龙脷叶总游离氨基酸含量测定

谭建宁 杜成智 梁臣艳 何翠薇

摘要：【目的】建立龙脷叶总游离氨基酸含量的测定方法，为龙脷叶药材质量控制及其开发利用提供参考依据。【方法】以谷氨酸为对照品，通过正交试验优化龙脷叶总游离氨基酸的提取条件，并利用紫外—可见分光光度法测定其含量。【结果】龙脷叶总游离氨基酸最佳提取条件为：龙脷叶粉碎过20目筛、液料比25.0∶1、提取时间1.5 h，其中粉碎度和提取时间对龙脷叶总游离氨基酸提取效果的影响显著（P<0.05）。568 nm是龙脷叶供试品溶液和谷氨酸对照品溶液的检测波长；谷氨酸在20.0～60.1 μg/mL范围内与吸光值呈良好的线性关系（R2=0.9991）。在最佳提取条件下，测得6批龙脷叶总游离氨基酸含量（以谷氨酸计）在2.82%～6.77%，平均含量为4.50%。【结论】采用紫外—可见分光光度法测定龙脷叶总游离氨基酸含量，操作简便、结果准确，可作为龙脷叶总游离氨基酸的质量控制方法。

关键词： 龙脷叶；总游离氨基酸；紫外—可见分光光度法；正交试验；含量测定

中图分类号： R284.2 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2016）04-0645-05

0 引言

【研究意义】龙脷叶为大戟科植物龙脷叶（Sauropus spatulifolius Beille）的干燥叶（国家药典委员会，2015），主要分布于广西、广东、福建等地，作为广西常用中草药已被《广西本草选编》（广西壮族自治区革命委员会卫生局，1974）和《广西药用植物名录》（广西壮族自治区中医药研究所，1986）收载。龙脷叶为广西特色中药，具有通气道、润肺止咳、滑肠通便等功效，是临床上常用壮药（广西壮族自治区食品药品监督管理局，2008）。龙脷叶既可药用，又可食用，华南地区民间常用其煲凉茶以祛痰化湿，也可与瘦猪肉或猪肺同煮，对肺热咳嗽、失音、喉痛、急性支气管炎、上呼吸道炎等症具有一定的保健作用。广西龙脷叶资源丰富，深入研究其药用成分，对龙脷叶的药用开发与利用具有重要意义，也有利于促进广西中药民族医药的可持续发展。【前人研究进展】龙脷叶含有皂苷、甾体类和氨基酸等成分（广东省食品药品监督管理局，2004），但目前有关龙脷叶化学成分研究的文献报道较少，且主要集中在龙脷叶水提物的作用研究。汪小根和邱蔚芬（2007）采用气—质联用分析法从龙脷叶挥发油中鉴定出16种成分，主成分为棕榈酸（28.43%）、金合欢基丙酮（8.82%）等。刘蓉（2009）的研究结果表明，龙脷叶的水提物为低毒性，对急、慢性炎症均有明显的拮抗作用，并有较强的抑菌作用。黄燕等（2014）采用连续二倍梯度琼脂稀释法研究龙脷叶水提液和50%、70%、95%乙醇提取物的抑菌活性，结果显示，龙脷叶水提液和50%乙醇提取物的正丁醇部位对6种试验菌株有明显的抑制作用。陈珍（2014）采用薄层鉴别法考察龙脷叶水提液的正丁醇萃物，并对皂苷和氨基酸部分进行定性鉴别，显色后，可见明显的斑点出现。何鹏等（2014）采用高效液相色谱法对15批龙脷叶中具有抗炎、止咳、解痉、抗溃疡等功效的黄酮苷成分山柰酚-

3-O-龙胆二糖苷的含量进行测定，得知其平均含量为0.0446%。【本研究切入点】游离氨基酸是一种重要生物活性物质，参与植物中氮和蛋白质的代谢（Egydio et al.，2013）。龙脷叶水提液中含有氨基酸，但至今未见有关龙脷叶中总游离氨基酸含量测定的研究报道。【拟解决的关键问题】以谷氨酸为对照品，通过正交试验对龙脷叶总游离氨基酸的提取条件进行优化，并利用紫外—可见分光光度法测定其含量，建立一种快速、准确测定龙脷叶总游离氨基酸含量的方法，为龙脷叶药材质量控制及其开发利用提供参考依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

龙脷叶药材于2014年6～10月分3次购自玉林药材批发市场，其中批号141001和141002（产地：广西靖西县）购于6月，批号141003、141005（产地：广西梧州市）和批号141004（产地：广西玉林市）购于8月，批号141006（产地：广西梧州市）购于10月。

谷氨酸对照品（批号140690-201203）购自中国食品药品检定研究院；95%乙醇、冰乙酸、茚三酮、醋酸鈉、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、邻苯二甲酸氢钾、氢氧化钠均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。试验用水为去离子水。主要仪器设备：8453型紫外—可见分光光度计（美国安捷伦公司）、BP211D电子天平（德国赛多利斯公司）、CD-UPT超纯水机、KQ5200B型超声提取仪、DK-98-∏A恒温水浴锅、FW135型中草药粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）、PHS-25 pH计（上海仪电科学仪器股份有限公司）、BT600电子天平（南通市启东友铭衡器有限公司）。

1. 2 溶液配制

1. 2. 1 谷氨酸对照品溶液制备 精密称取25.06 mg谷氨酸置于25 mL容量瓶中，以去离子水溶解，定容至刻度，作为储备液。精密吸取上述储备液5.0 mL置于50 mL容量瓶中，以去离子水定容至刻度，制得100.2 μg/mL谷氨酸对照品溶液。

1. 2. 2 供试品溶液制备 精密称量龙脷叶药材（批号141005）粉末（过20目筛）4.0 g置于250 mL具塞锥形瓶中，加入100.0 mL去离子水，称定重量，提取1.5 h；补足重量，摇匀，静置后以0.45 μm微孔滤膜过滤，取滤液作为供试品储备液。精密吸取上述供试品储备液0.5 mL置于25 mL容量瓶中，以去离子水稀释至刻度，作为供试品溶液。

1. 2. 3 pH 6.0缓冲溶液配制 取醋酸钠54.6 g，加20.0 mL 1 mol/L醋酸溶液溶解后，加水稀释至500.0 mL，即得pH 6.0缓冲溶液。

1. 3 检测波长选择

精密吸取供试品溶液和谷氨酸对照品溶液各1.0 mL，分别置于10 mL试管中，再加入pH 6.0缓冲溶液2.0 mL和2.0%茚三酮溶液1.5 mL，置于沸水中加热15 min，显色。采用紫外—可见分光光度法，用1 cm比色皿，以试剂空白作参比，在400～800 nm范围内扫描吸收曲线，确定检测波长。

1. 4 标准工作曲线绘制

准确吸取2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL谷氨酸对照品溶液分别置于10 mL容量瓶中，以去离子水定容至刻度，摇匀，作为谷氨酸标准溶液系列液；依次吸取1.0 mL置于10 mL试管中，分别加入pH 6.0缓冲溶液2.0 mL和2.0%茚三酮溶液1.5 mL，沸水中加热15 min，显色。以试剂空白作参比，于568 nm处测定吸光值。以谷氨酸质量浓度为横坐标、吸光值为纵坐标，绘制标准工作曲线（图1），其回归方程为：y=0.0128x+0.0424（R2=0.9991）。谷氨酸在20.0～60.1 μg/mL范围内与吸光值的线性关系良好。

1. 5 龙脷叶总游离氨基酸提取正交试验

在预试验的基础上，选择以去离子水超声波提取龙脷叶总游离氨基酸。选取对龙脷叶总游离氨基酸提取影响较大的药材粉碎度（A）、提取时间（B）、液料比（C）作为考察因素，进行L9（34）正交试验。称取龙脷叶药材（批号141005）9份，按照1.2.2的方法制备供试品溶液，按照1.4的方法显色，于568 nm处测定吸光值。正交试验因素水平设计见表1。

1. 6 验证试验

取龙脷叶药材（批号141005）粉末（过20目筛）5份，在最佳提取工艺下进行总游离氨基酸提取，按照1.2.2的方法制备供试品溶液，按照1.4的方法显色后，于568 nm处测定吸光值，验证最佳提取工艺的可靠性。

1. 7 龙脷叶总游离氨基酸含量测定

精密称量6批龙脷叶药材，按照1.2.2的方法制备供试品溶液，分别精密吸取1.0 mL置于10 mL试管中，摇匀；按照1.4的方法显色后，以试剂空白作参比，于568 nm波长处测定吸光值，每个样品平行测定3次，计算龙脷叶总游离氨基酸含量（以谷氨酸计）。计算公式如下：

总游离氨基酸含量（%）=C×5000×V×100/（M×106）

式中，C为供试品溶液测得的吸光值代入标准工作曲线后计算的谷氨酸质量浓度（μg/mL），V为供试品溶液体积（mL），M为龙脷叶药材质量（g）。

2 结果与分析

2. 1 检测波长的确定

在400～800 nm范围内扫描龙脷叶供试品溶液与谷氨酸对照品溶液的吸收曲线，结果（图2）显示，供试品溶液與谷氨酸对照品溶液的最大吸收波长均为 568 nm，因此，确定568 nm作为检测波长。

2. 2 龙脷叶总游离氨基酸提取条件的确定

由表2可知，影响龙脷叶总游离氨基酸提取效果的因素主次排序为：A>B>C，即粉碎度是主要影响因素，其次为提取时间，而液料比的影响相对较小；其中，粉碎度和提取时间对龙脷叶总游离氨基酸提取效果有显著影响（P<0.05）（表3）。最佳提取工艺组合为A3B3C2，即龙脷叶总游离氨基酸最佳提取工艺条件为：粉碎过20目筛、提取时间1.5 h、液料比25.0∶1。

2. 3 验证试验结果

验证试验结果表明，在工艺组合A3B3C2的提取条件下，龙脷叶总游离氨基酸平均含量为6.77%，高于正交试验各组合的含量，说明正交试验结果可靠。龙脷叶总游离氨基酸最佳提取条件确定为：过20目筛粉碎、提取时间1.5 h、液料比25.0∶1。

2. 4 龙脷叶总游离氨基酸含量的测定结果

从表4可以看出，6批龙脷叶总游离氨基酸含量存在较大差异，以购于8月批号141005（产地：广西梧州市）的含量最高，为6.77%；其次是同样购于8月的批号141003（产地：广西梧州市），其总游离氨基酸含量为6.50%；总游离氨基酸含量最低的是批号141001（产地：广西靖西县），为2.82%；6批龙脷叶总游离氨基酸的平均含量为4.50%。

3 讨论

氨基酸成分的测定常采用紫外—可见分光光度法、氨基酸自动分析仪法、高效液相色谱法、气相色谱法等。其中，氨基酸自动分析仪法测定的氨基酸为盐酸水解蛋白质和植物本身含有的游离氨基酸，但过层析柱后需与水合茚三酮衍生剂衍生，造成峰形变宽，分辨率降低；高效液相色谱分析法测定的是在分离蛋白或限制蛋白水解条件下各游离氨基酸含量，分析时需在过层析柱前衍生，易污染色谱柱，造成柱效降低；气相色谱法需把氨基酸衍生为易气化的物质，且适用于氨基酸衍生的衍生试剂不多，衍生操作复杂（刘荣森等，2007；吴琴燕等，2014）。紫外—可见分光光度法常用于测定总游离氨基酸，显色剂主要有茚三酮、吲哚醌等（曾俊和苏俊黎，2003；黄松等，2010），可直观反映植物中本身含有的游离氨基酸含量，操作简便，准确可靠，且仪器价格低廉。

本研究采用紫外—可见分光光度法测定龙脷叶总游离氨基酸含量，结果显示，不同批次间的龙脷叶总游离氨基酸含量差异较明显，含量最高和最低相差近2.5倍。广西靖西县的两批龙脷叶总游离氨基酸含量在6批药材中最低，仅为2.82%和2.74%；购于8月的3批龙脷叶药材中有广西梧州和玉林市两个产地，其中广西梧州市的两批药材含量高，分别达6.50%和6.77%，广西玉林市的龙脷叶总游离氨基酸含量仅3.66%，相差近1.8倍；分别购于8月和10月的龙脷叶，产地同为广西梧州市，购于10月的龙脷叶总游离氨基酸含量相较于8月的含量有所下降，为4.51%。因此推测龙脷叶总游离氨基酸含量受产地、采收时间等因素影响较大，但具体原因有待进一步探究。氨基酸含量高低决定植物的品质，6批龙脷叶总游离氨基酸的平均含量为4.50%（以谷氨酸计），高于铁皮石斛总氨基酸含量0.327%（以天冬氨酸计）（王培培等，2013），提示龙脷叶品质高，可作为保健食品进一步开发和利用。

氨基酸的存在形式一般有两种，一种是游离态，一种是结合到蛋白质中。游离氨基酸的抗感染能力显著，有研究表明，游离氨基酸中的组氨酸、苏氨酸缺乏可促使小鼠对伤寒沙门氏菌的易感性增高，赖氨酸缺乏导致小鼠对炭疽芽孢杆菌的抵抗力下降，而皮下注射半胱氨酸可增强动物一些非特异性免疫功能及对葡萄糖球菌毒素的抵抗力（徐琪寿，1996）。本课题组前期研究发现，龙脷叶中含有谷氨酸、组氨酸、苏氨酸、赖氨酸等多种游离氨基酸；本研究测定龙脷叶总游离氨基酸含量，可为深入研究龙脷叶抑菌、抗炎、镇痛等活性成分提供实验基础。下一步将对多种游离氨基酸的含量进行测定，为龙脷叶药材资源的综合利用提供更多理论依据。

4 结论

采用紫外—可见分光光度法测定龙脷叶总游离氨基酸含量，操作简便、结果准确，可作为龙脷叶总游离氨基酸的质量控制方法。

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（责任编辑 罗 丽）