甘蔗染色体研究近况

沈姣　王凯　张文盼　董广蕊　石岩　张积森

摘 要 甘蔗是非整倍性异源多倍体作物，遗传背景高度复杂，其细胞生物学研究难度大。近年分子标记技术以及原位杂交技术等快速发展使甘蔗细胞学研究也取得明显进展。本文主要围绕甘蔗核型、染色体行为、原位杂交技术在甘蔗上的应用展开综述，以期为高倍体植物细胞学研究提供参考。

关键词 甘蔗；多倍体；染色体；原位杂交技术

中图分类号 TQ352 文献标识码 A

Abstract Sugarcane is an euploid allopolyploidy with complex genetic background， its cytological study was thus considered to be challenging. In these years，significant progresses for the cytology of sugarcane have been made based on the rapid development of molecular marker technology and in situ hybridization. Here， to provide the reference for cytological study in high polyploidy plant， we reviewed the germplasm resources， karyotype， chromosome behavior， and in situ hybridization technique for sugarcane.

Key words Sugarcane； Olyploidy； Chromosome； In situ hybridization

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.07.030

甘蔗（Saccharum officinarum）属是禾本科甘蔗亚族中10个属之一，与蔗茅属（Erianthus）、芒属（Miscanthus）、河八王属（Narenga）组成“甘蔗属复合体（Saccharum Complex）”。甘蔗属主要包括6个成员，热带种（S. officinarum L.）、中国种（S. sinense Roxb.）、印度种（S. bareri Jesw.）、割手密（S. spontaneum L.）、大茎野生种（S. robustum Brandes and Jeswiet ex Grassll）和食穗种（S. edule Hassk）[1]，前三者为栽培种，其余为野生种。

甘蔗是一种以非整倍性和多倍性而著称的多年生热带亚热带作物，作为一种C4植物，甘蔗能高效将太阳能转化为化学能，是工业生产上较高的能源作物之一。因此，对甘蔗开展进一步研究具有重要意义。但是甘蔗染色体数目多，形态相似，压片技术难以把握、遗传背景复杂等困难给研究工作带来了极大的挑战，一直以来取得的科研成果难以给后来研究者提供可靠的依据，因此，甘蔗细胞学的研究特别是分子水平的研究难以取得突破性的进展。本文综述了近几十年来甘蔗核型、染色体行为、原位杂交技术在甘蔗上应用的研究近况，期望为甘蔗分子生物学研究乃至多倍体作物细胞生物学研究工作提供理论参与。

1 甘蔗染色体核型

1.1 核型概况

栽培种甘蔗是异源杂合非整倍体作物，染色体数目较多（一般2n>100），形态小、相似性较高，因此，对精确分析甘蔗核型的工作带来了挑战，随着过去20 a许多科研工作者对甘蔗研究的不断努力，在甘蔗染色体形态、大小、数目、基因结构、进化等诸多方面有了初步了解。甘蔗染色体大小为1～6 μm左右，属于禾本科植物中较小的染色体，且不同染色体的大小非常接近，不易辨认[2-3]。甘蔗染色体大多数为中部着丝点（m）染色体，少部分为近中部着丝点（sm）染色体，核型大部分为2B型，甘蔗近缘种斑茅为1A型染色体[4]，根据Stebbins[5]植物染色体核型按对称性程度高低分类（1A、2A、3A、4A；1B、2B、3B、4B；1C、2C、3C、4C）标准，甘蔗属以及近缘属染色体都属于较原始的核型。上述研究结果还表明了随着祖亲代野生种向高世代杂交栽培种的演化，表现出一致的特征：随着杂交次数及祖亲血缘的不断增加，染色体数目将按一定的方式增加，中部着丝点染色体所占比例逐渐减少，核型从对称向不对称方向演化，基本符合物种进化趋势。

1.2 异染色质与物种进化研究

甘蔗属的染色体异染色质程度高低不同。对甘蔗3个品种Giemsa-C带分析表明：割手密野生种和热带种异染色质程度较低，中国种异染色质含量高[6]。据有关报道[7]高等生物异染色质含量多少与物种进化程度高低有关，所以中国种应该是进化程度较高的物种，割手密是进化上较为原始的物种。同时庄伟建对甘蔗4个种十多份材料进行了染色体形态学研究，其中割手密和热带种的染色体较对称，而中国种和印度种的染色体较不对称[6]，即印度种和中国种进化程度较高。尽管没有直接的证据，大家一般认为食穗种是热带种或大茎野生种与近缘属种杂交而来，加上一直以来都假定大茎野生种是热带种的祖先，以及大茎野生种可能由割手密种和蔗茅属、硬穗茅属和芒属发生基因渗透进化而来[8]，Waldrona和Glaszioud[9]的酯酶同工酶分析支持割手密作为甘蔗进化起点，以上论点可作为推测甘蔗属中6大种进化程度关系的依据。

1.3 染色体数目探索

染色体是遗传物质的主要载体，染色体数目的变化与表现型的变异关系密切。观察作物的染色体已成为作物育种和细胞遗传的重要研究手段。甘蔗染色体数目多，并且品种之间染色体数目变化幅度大，即使同一品种在不同组织或不同生育期，观察到的染色体数目也不尽相同[10]。下面将具体介绍甘蔗不同种属的染色体数目情况：

热带种（S. officinarum L.），较早开始甘蔗研究工作的Bremer博士和Sreenivasan博士确认了热带种的染色体数目为2n=80，当初也发现了染色体数目不是2n=80的无性系，他们认为此类无性系可能是杂种。随着分子细胞学技术的发展，这一推测逐渐被证实[11-12]。

割手密（S. spontaneum L. SES），染色体数目分布广泛，倍性水平多（2n=40～128，五倍体、六倍体、八倍体、九倍体、十倍体等），同时也是甘蔗属中拥有最少染色体数的种（2n=40）。据我国甘蔗研究人员[13-15]的考察和鉴定，割手密的染色体数目，具有2n为40、48、56、60、64、72、80、96、l04、l08、128等多种不同类型。2n=64、80和96 3种细胞类型出现的频率较高。来自云南、四川、福建、广东、贵州、江西6个省份的106份甘蔗野生种割手密无性系染色体数目的变化，预示由南向北，随着纬度的增高、海拨的变化，割手密的染色体数目在增加，染色体类型在扩大[15]。造成如此多种类型的原因可能是由于割手密无性系不同类型间的花期常相互连接，杂交机会多，产生多种类型的天然杂种。

大茎野生种（S. robustum Brandes and Jeswiet ex Grassll）的染色体数目为2n=60、80[16]，染色体数目通常不变。印度种和中国种的染色体数目却不固定，印度种的染色体数变动在82～124之间，而且这种变动似乎与其地理分布有一定联系；中国种的染色体数则变动在115～123之间。更为详细的细胞学研究还显示，印度种和中国种不仅不同无性系染色体数目不同，甚至同一无性系内细胞与细胞之间的染色体数目也都是变化的，减数分裂时染色体数目的变异则更大。

据报道，蔗茅属（Erianthus）各个种的染色体数目有2n=20、22、24、30、40、60，其中斑茅的染色体数可以为2n=20，40，60[13]。芒属（Miscanthus Anderess）其各个种的染色体数在2n=38～141之间，硬穗属（Sclerostachy A. Camus）染色体数为2n=30或34，河八王属（Narenga Bor.）染色体数为2n=30。

甘蔗以茎进行无性繁殖过程中，体细胞染色体数目的变化会发生累积。当染色体数目增减变化累积到一定程度时，必然会引起遗传结构及其所决定的重要农艺性状的变异，这可能是甘蔗品种在生产上应用无性繁殖技术一段时间后，农艺性状变差（品种退化）的细胞遗传学原因之一[17]。因此，在甘蔗育种和生产应用时，选择细胞周期相对一致的杂交亲本对培育和保持新品种的优良特性至关重要。

1.4 染色体基数的确定

对于多倍体物种而言，染色体基数是指单一染色体组内所含有的染色体数目，以x表示。对于甘蔗属基本染色体数目的确定经历了很长一段时间的推导，1991年以前，大家公认为甘蔗属和须芒草属一样，基本染色体数为10[18]，随着最小染色体数2n=40的割手密种的发现，打破了基本染色体只有10的这一观点。目前有研究人员认为甘蔗属基本染色体数应该为x=5，8，10[19]，也有人认为是x=10，12[20]，Bremer[21]则指出甘蔗属有3个基本染色体数目x=6，8，10。因此，甘蔗属不同群体的多倍性系列以及基因组的平行进化2个因素导致了基本染色体数的不同[3]。随着原位杂交技术的出现，利用45S rDNA基因和5S rDNA基因作为确定甘蔗染色体基数的工具，验证了割手密染色体基数为8[22]，大茎野生种、热带种和蔗茅属的染色体基数为10[23-24]，芒属单倍体染色体数为19。

2 甘蔗染色体的遗传行为

2.1 减数分裂中的染色体配对

减数分裂过程中的染色体配对是细胞生物学的一项重要特征，因为染色体的配对行为是染色体间同源关系和进化历程的体现。尽管甘蔗的高倍性水平，但主要还是以二价体配对为主，单价体三价体出现较少[25]。这就与认为甘蔗是一种异源多倍体的传统观念是相违背的，因为异源多倍体是严格的二价染色体配对，当然也不是严格的同源多倍体配对模式，而是一种协调的多倍体配对模型，即既有异源多倍体染色体配对行为又有同源染色体配对行为，这种协调模型广泛存在多倍体物种中[26]。通过对连锁图上分子标记在分斥相分离情况的剖析，能够清楚地鉴定减数分裂时染色体的配对行为。在对SES 208[27]和SES 147B[28]这2种割手密进行连锁群构建时，没有出现分斥相，即每条染色体可以自由和另外7条同源染色体配对。热带种8个连锁群和大茎野生种的7个连锁群则表现出偏好配对[29]。目前为止，在甘蔗减数分裂过程中占主导方向的仍是偏好配对[30]，且时常会表现出不同的配对亲和力[26]。

2.2 减数分裂行为解释2n配子的形成

正常减数分裂产生的是单倍体配子（n），减二后期会观察到四分体，不正常减数分裂则会形成二倍体配子（2n），在显微镜下看到的则是二分体或者三分体。无论是杂交种还是纯种都会产生二分体和三分体，但是这2种形式在杂交种中出现的频率要明显高于纯种；纯种品系中，热带种相对于割手密会更容易产生2n配子。从分子水平上来分析，是由于在杂交种中，调节染色体联会和分离的基因更容易丢失[25]，在细胞学上表现为染色体缺失、片段化和丢失等[31-32]。这些调控基因一旦丢失，基因组内的遗传调节因子就会混乱互作，从而导致非整倍体以及2n配子的产生。遗传调节因子混乱互作致使减数分裂行为不正常，包括后期桥的形成，染色体分裂滞后，分裂不同步，胞质不分离等，主要机制有4种：第一次分裂后复原（First division restitution，FDR）；第二次减数分裂后复原（Second division restitution，SDR）；大孢子四分体融合（Megaspore tetrad cell fusion，MTCF）和减数分裂后复原（Post-meiotic restitution，PMR）。在其他植物中，前2种机制占主导地位[33]。而在甘蔗中，大孢子分裂过程是一个连续的过程，因此，在甘蔗中就不可能用FDR也不能用纺锤丝未形成去解释2n的形成[25]，Bremer等[34]在种植甘蔗时发现，虽然有少数SDR的例子，但是常见的却是PMR机制。用一系列分子标记技术去追踪减数分裂过程时，认为SDR/MTCF更能解释2n配子产生现象[35]。然而，对甘蔗2n配子形成机制的了解还处在初步探索阶段，没有统一定论。

3 原位杂交技术及其在甘蔗上的应用

原位杂交（in situ hybirdization）技术是一种把核酸分子杂交技术与组织学定位相结合的DNA分子标记技术，具有特异性强、灵敏度高、定位准确等特点[36]。该项技术已广泛应用于动物基因组重复序列、单拷贝或多拷贝基因家族的染色体定位、杂种亲本染色体的鉴定、染色体的结构分析、外源染色质检测、物种进化及亲缘关系与染色体物理图谱构建等的研究。但在植物染色体上的应用受到植物细胞壁的屏蔽作用、细胞质的覆盖影响，使得植物荧光原位杂交技术的染色体制片环节相当困难。尤其是数目多又变化较大的甘蔗染色体，使得原位杂交技术在甘蔗上的应用起步较晚。

3.1 原位杂交技术在甘蔗上的应用

3.1.1 基因定位研究 甘蔗染色体基因定位具有显著成效的工具当属rDNA，主要是45S rDNA基因和5S rDNA基因。用45S rDNA基因标记为探针分别与热带种、大茎野生种和割手密染色体进行原位杂交，结果探针被定位于热带种和大茎野生种染色体末端、割手密染色体次缢痕处，而5S rDNA基因在各物种中的位置与45S rDNA基因定位情况完全不同，荧光原位杂交技术检测出5S rDNA信号位于热带种和大茎野生种染色体缢痕处、割手密的染色体间质区[2-3]（图1）。5S rDNA在2n=96的Mandalay和2n=112的Glagah 2个割手密种上可检测出12和14个信号点，然而，在进行45S rDNA定位时却只出现10和12个信号位点，且其中5个信号很微弱，几乎难以检测到。信号强弱反映了45S rDNA在各个染色体上拷贝数的不同[2]。45S rDNA位点缺失这一推理近年来在其他多倍体物种上得到了验证[37-38]。Arrighi[39]甚至还提出在多倍体进化过程中物种通过染色体畸变的方式，主要是基因的缺失，去维持恒定的45S rDNA位点数目，从而导致位点数与倍性水平不一致，相反5S rDNA位点却与倍性水平具有明显的相关性，且5S rDNA在染色体上分布模式不一，在不同染色体上的拷贝数也存在较大的差异。

3.1.2 基因组结构的分析 现代栽培甘蔗是热带种（S. officinarum L.）与割手密（S. spontaneum L.）杂交后，还经过了少于八代的杂交[35]，从而使其基因组结构复杂，甘蔗基因组比其他任何多倍体都要复杂。以前，大家都认为2个亲本之间没有染色体重组[40-41]。GISH技术清晰证明了现代甘蔗栽培种大约有 70%～80%的染色体来自于热带种，10%～23%全部来自于割手密，另外5%～17%来源于热带种和割手密的重组[12，42]。20世纪90年代以前，对于印度种和中国种基因结构组成的看法很多[8，43]，D'Hont[44]反复验证了印度种和中国种是热带种和割手密的杂交种，其中并没有检测出其它种质。可见，基因组荧光原位杂交（GISH）这项分子细胞遗传学技术是一种研究复杂多倍体基因组结构直接有效的方法，将为其他未知多倍体基因组结构的分析提供有力工具。

3.1.3 染色体传递方式的确定 由于甘蔗属多为异源多倍体植物，其染色体组成及传递方式较为复杂和独特。有性杂交过程中，亲子代染色体传递往往不符合经典的细胞遗传规律，而是表现出多种染色体传递方式：n+n，2n+n，n+2n，2n+2n[12，45]。通常情况下，热带种与割手密的杂交规律为：热带种倾向于产生2n配子，割手密形成n配子，即F1染色体传递方式为2n+n[46]；BC1代染色体传递方式大体上为2n+n，BC2代为n+n[21]，验证了当双亲中都含有割手密染色体时，n+n传递方式起主导作用[47]。热带种与中国种和现代栽培种杂交时子代也表现出2n+n的遗传方式[12]。然而热带种与甘蔗其他种属的杂交情况却截然不同，热带种与热带种杂交或者与大茎野生种杂交时，染色体的传递方式为n+n[46，48]。甘蔗属与甘蔗近缘种属斑茅杂交的F1和BC2（BC1×商品蔗）代中，染色体传递方式为n+n，BC1（F1×商品蔗）代中则是2n+n[45，49]，而其中2n和n常常不是体细胞、配子原来数目，常有增减，即存在“不平衡”现象[50]，体现了甘蔗染色体传递方式的复杂性。甘蔗有性杂交过程中，一个比较明显的趋势就是父本给后代总是传递n配子，这是一种在远缘杂交不亲和性引导下的一种母本保护机制，即阻止外来遗传物质进入母本[32]。

3.1.4 染色体结构变异现象的发现 亲本在传递2n和n配子过程中，常常少于体细胞、配子原来数目，这其实与染色体的丢失有关[31]。利用FISH技术在甘蔗属与斑茅的杂交子代中不仅清晰看到了染色体的丢失[42，51]，而且发现了甘蔗属与斑茅之间的染色体重组现象[32，52]。常见的一种染色体重组方式就是易位，黄永吉[49]研究表明在甘蔗属与斑茅的BC1、BC2和BC3子代染色体中都存在易位，且分为2种主要的易位形式：S/E型，这种染色体由包括甘蔗属着丝粒的大部分和斑茅端部染色体片段构成；相反，E/S型，就是包括斑茅着丝粒的大部分染色体和甘蔗属部分端部染色体组成的染色体类型。易位这种染色体变异可以稳定遗传给后代，这就为新生遗传型和表型的产生提供可能。王先宏[32]田间试验发现，杂交子代的各种农艺性状都超过了亲本，如：生长速率、株重、蔗杆直径、蔗糖产量等，这可能与斑茅染色体缺失和丢失不利基因以及染色体重组产生的杂交优势有关，这将为甘蔗育种事业带来深远影响。

染色体结构改变也能为物种进化提供可能。通过甘蔗遗传图与高粱基因组的共线性分析[53，54]，得出在2个物种分化后，甘蔗发生了多次染色体重组事件，其中2次主要重组事件对甘蔗物种的形成产生了重要的影响，一是Sb2（高粱二号染色体，下同）和Sb8组成甘蔗同源群HG8，Sb5和Sb6变成同源群HG2，即原来对应高粱的2号和8号染色体融合成甘蔗的一条染色体，5、6号染色体融合成另一条染色体，因此在高粱中染色体基数X=10，慢慢演化成了染色体基数为X=8的割手密。在甘蔗近缘属芒属（Miscanthus sinensis.）中也出现类似的情况：芒属和高粱分开后，两条染色体融合成一条染色体，染色体数目减少到x=19[55]。2条染色体通过相互间染色体易位融合成一条染色体的过程，在禾本科植物中出现得比较多[56-57]。巨大的染色体结构变异也许解释了割手密的不同倍性水平、地理分布范围广泛的由来，以及甘蔗属、甘蔗近缘属能适应各种生物和非生物胁迫环境的原因。

着丝粒由DNA和蛋白质组成，是真核生物有丝分裂和减数分裂过程中染色体正确分离和传递所必需的染色体区域，虽然着丝粒的功能非常保守，但真核生物各物种的着丝粒DNA序列却高度变异，相比之下，着丝粒蛋白在物种间则相对保守，发挥功能的蛋白主要是CENH3，Nagaki[58-59]推导出甘蔗的氨基酸序列与玉米水稻着丝粒蛋白CENH3序列极为相似，因此用水稻的CENH3抗体去与甘蔗的SoCENH3进行免疫共沉淀（ChIP），分析沉淀下来的DNA序列信息，得出甘蔗的SoCENH3中有140 bp的串联重复序列（SCEN）和甘蔗逆转座子重复（CRS）序列，这2种序列都表现出着丝粒特异性，杂交信号大小不一，CRS信号比SCEN信号多且强。由此说明甘蔗着丝粒重复序列包含串联重复和逆转座子重复，SCEN家族和CRS家族序列变化大，并且其中大部分是逆转座子重复。

3.1.5 甘蔗着丝粒组成 甘蔗基因组测序是目前甘蔗分子生物学基础研究的重要攻关点。而甘蔗基因组的复杂性以及广泛存在的重复序列尤其是着丝粒上的串联重复和逆转座子重复，必将阻碍甘蔗全基因组测序中用BACs克隆进行的重叠群（contig）组装，加之，自动化组装无法填补重叠群之间的间隔。然而，高分辨FISH细胞学技术却可以确定不同克隆之间的排列顺序，还可以用于估算在同一染色体上重叠群间间隔的长度，定量分析不同克隆之间的重叠程度和实际距离，从而实现重叠群的组装，逐步完成甘蔗全基因组测序工作。

4 展望

本文从甘蔗染色体核型、甘蔗染色体遗传行为以及原位杂交技术在甘蔗上的应用3个方面简单综述了甘蔗染色体研究近况，对甘蔗分子生物学和多倍体作物细胞生物学研究工作提供了一定的理论基础。

甘蔗染色体的异质性、多倍性、非整倍性、减数分裂不规则、染色体传递方式的复杂性等因素制约着甘蔗细胞学的发展。要想进一步了解甘蔗细胞学特征，得寻求新的技术支持，FISH则是细胞遗传学上具有里程碑式意义的一项技术，可望克服甘蔗细胞学研究中遇到的困难，使我们能够了解甘蔗染色体结构细节，分析基因组结构，并加速对甘蔗遗传和进化机制等领域的了解，从而进一步推动甘蔗遗传育种改良进程，促进甘蔗生产发展。

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