利用SRAP标记绘制中国芥菜基因源分子指纹图谱

王玉红 金关荣 陶爱芬 祁建民

摘 要 以中国9个省份和地区的86份芥菜种质资源为供试材料，利用SRAP分子标记和DNA指纹图谱分析软件，绘制芥菜遗传资源基因组DNA指纹图谱。从270对SRAP引物中筛选出40对多态性明显、条带清晰的引物组合，对86份供试材料基因组DNA分子进行扩增，共扩增出632条谱带，其中多态性条带427条，多态性比率为67.56%，表明芥菜种质资源遗传多样性较丰富。以供试的86份芥菜种质资源的SRAP扩增条带为基础，建立供试材料扩增条带指纹数据库的Excel文件，然后利用自主开发的DNA指纹图谱软件，构建86份芥菜种质资源的DNA指纹图谱，获得了所有芥菜种质资源的分子“身份证”。结果表明，SRAP分子标记非常适合芥菜DNA指纹图谱的构建。

关键词 芥菜；种质资源；DNA指纹图谱；SRAP标记

中图分类号 S637 文献标识码 A

芥菜[Brassica juncea（L.） Czern et Coss]是十字花科（Cruciferae）芸薹属的重要物种，是原产中国的重要蔬菜之一，具有重要的经济价值，其栽培历史悠久，分布广泛，有十分丰富的品种和变种[1-2]。近年来，随着分子标记技术的迅速发展，SSR[3]，RAPD[4-5]，ISSR[6]，AFLP[7]等分子标记技术已广泛应用于芥菜遗传多样性的研究中，但SRAP分子标记应用于芥菜遗传多样性的分析目前仅见到李宁等[8]的报道。SRAP是一种操作简单，重复性好，多态性高，扩增结果稳定的高效分子标记方法[9]，已经成功应用于包括芸薹属在内的许多作物的遗传多样性研究上[10-11]。

DNA指纹图谱是建立在DNA分子标记基础之上，能够鉴别生物个体之间差异的DNA电泳图谱。因其技术简单、快速、稳定，非常适合于品种资源的鉴定[12-14]。目前，该技术已在多种作物品种纯度鉴定，品种分子身份证构建等方面得到广泛应用，并发挥着越来越重要的作用[15-20]。芥菜变种丰富，仅从形态学上难以进行品种区分，因此采用SRAP分子标记方法绘制其DNA指纹图谱，通过构建其独特的“分子身份证”建立中国芥菜基因源的分子数据库，对深化种质资源发掘利用、品种识别鉴定、种子纯度鉴定等均有重要的科学意义和实际应用价值。但目前国内外鲜见关于芥菜种质资源DNA指纹图谱绘制的报道，此方面的研究有待深入，因此本研究具有创新性和必要性。

1 材料与方法

1.1 材料

供试芥菜材料共86份（表1），有叶用、茎用、根用和瘤用4种类型，来源于中国东南部的福建、浙江及香港地区；西南部的广西和重庆；中原以北的河南、北京和黑龙江等9个省份和地区。供试材料由浙江萧山棉麻研究所和福建农林大学作物遗传改良研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA提取 每份材料在四叶期取5株单株幼嫩叶片混合，参照徐建堂等[21]改良的CTAB 法提取基因组DNA。用1%（W/V）琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，并用蛋白质核酸检测仪检测其浓度和纯度。

1.2.2 SRAP分子标记分析 选择4份形态学差异明显的芥菜种质：严选水东鸡心芥菜、厘浦花芥菜、福上芥3和大光头芥菜，对270对SRAP引物进行多态性筛选，共筛选出40对多态性理想的引物用于86份芥菜种质资源的PCR扩增。PCR反应总体系为15 μL，其中2×Taq PCR Master Mix（由厦门泰京生物技术有限公司提供）7 μL，DNA模板75 ng 0.8 μL，引物0.5 μL。SRAP-PCR扩增反应程序参照Li等[22]提出的方法并作优化改良，具体如下：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s；35 ℃退火1 min；72 ℃延伸1.5 min，5个循环；94 ℃变性30 s，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物在10%（W/V）非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，银染检测。

1.2.3 DNA指纹图谱构建 用DNA指纹图谱分析软件[16]对引物扩增序列中的特异性和共性做出明确的分析，并可进行物种识别。在相同迁移率位置上有扩增条带记为1，无扩增条带记为0，构建二元数据矩阵。将构建的二元数据矩阵导入DNA指纹图谱分析软件进行多态性和特异性分析，最终构建芥菜的DNA指纹图谱。

2 结果与分析

2.1 SRAP分子标记引物筛选及扩增

利用40对SRAP多态性引物对86份芥菜材料进行扩增，共扩增出632条谱带，其中多态性条带427条，多态性比率为67.56%。引物Me12-Em3扩增出的条带数最多，为21条。引物Me3-Em9和Me9-Em9扩增出的条带数最少，均为11条。多态性最高的引物是Me1-Em8、Me1-Em13和Me2-Em17，多态性比率达100%，而Me1-Em13扩增出的条带数多于Me1-Em8和Me2-Em17（表2）。这说明SRAP标记扩增效率高且多态性好。引物Me1-Em13对部分芥菜材料的扩增效果见图1。

2.2 DNA指纹图谱绘制结果分析

通过DNA指纹图谱分析软件绘制出了所有芥菜品种的SRAP指纹图谱（图2），揭示了本研究所有供试种质在分子水平上存在明显的遗传差异。在本试验中仅用筛选出的40对多态性引物中的10对组合，就可以构建出86份芥菜种质的DNA指纹图谱，其效率十分高，同时表明这86份芥菜种质在分子水平上存在明显的遗传差异性。其中，圆梗甜芥菜-1和圆梗甜芥菜-2，雪里蕻-2和雪里蕻-3，黄八仙和早花芥菜，福州盖山芥菜和福州宽杆芥菜，厘蒲花芥菜和芥菜-1，黄茼菜和大头菜-1等品种的DNA指纹图谱仅存在一个谱带位点上的差异，这说明它们的亲缘关系较近，遗传差异较小，但仍可鉴定或识别出其遗传水平上的差异。由此可见，SRAP分子标记非常适合芥菜品种间的DNA遗传差异鉴定和指纹图谱的构建。

3 讨论与结论

3.1 SRAP标记在芥菜DNA指纹图谱绘制上的可行性

利用分子标记进行DNA 指纹的构建时，遵循的原则之一是利用尽量少的标记识别尽量多的品种，以降低成本和提高检测效率，这就要求所用的标记多态性要好[20]。本研究表明，平均每对 SRAP多态性引物可扩增出15.8条条带，其中多态性条带比率为67.56%。尤其是引物Me1Em13能扩增出17条多态性条带，并且可以同时区分52份芥菜种质。由此可见，SRAP标记能够提供芥菜基因组DNA丰富的信息，是芥菜种质资源研究中快速、准确、有效的新技术。同时，SRAP分子标记重复性好，操作简单，在基因组中分布均匀，引物具有通用性，而且其正向引物可以与反向引物两两搭配组合，可用少量的引物组配得到多个引物对，提高了引物的使用效率，降低引物合成成本[23]。

3.2 SRAP分子标记在绘制DNA指纹图谱上的运用

本试验通过40对SRAP多态性引物进行芥菜种质资源分子标记分析，结果表明，仅用其中10对SRAP引物即可成功构建出国内86份芥菜种质的DNA指纹图谱，表现出很高的鉴别效率，是目前国内关于芥菜种质资源DNA指纹图谱构建的首次成功的探索性研究。试验结果表明，SRAP分子标记是芥菜DNA指纹图谱绘制的十分适用的技术。而指纹图谱绘制编程软件在本试验中的成功应用也是本研究的一大特色。目前，该软件已成功应用于黄麻[16]、红麻[20]等作物指纹图谱的绘制。其可对试验中获得的电泳图的二元数据矩阵进行搜索、编辑和分析处理，实现了电脑快速计算、快出结果，大幅度减少了人工的观察误差和计算时间，具有较高的科学性和分析结果的可靠性，适合芥菜指纹图谱分子数据库的构建。本研究可为中国芥菜分子数据库的建立和植物新品种特异性、一致性和稳定性审查及知识产权保护提供技术支撑。同时，可应用于商业化育种上品种知识产权的保护，可进一步提高中国植物品种管理和新品种保护的科学化、规范化水平。鉴于不同的分子标记各有独特的优点，对芥菜DNA指纹图谱的构建影响可能不同，因此今后可以结合多种分子标记进行分析，为芥菜的遗传资源的鉴定和保护利用等提供全面的分子水平上的信息。

本试验利用SRAP分子标记绘制了86份中国芥菜种质基因组DNA指纹图谱，是绘制芥菜种质资源分子身份证的一个重要突破。前人采用SRAP方法对芥菜种质资源进行了遗传多样性和亲缘关系研究，表明SRAP分子标记可以用于芥菜种质的研究上[8]，但未见采用SRAP方法绘制芥菜DNA指纹图谱的报道。林清等[24]采用5条 Scot标记引物绘制了46份芥菜种质的指纹图谱，平均每条引物可鉴别9份种质。而本研究采用10对SRAP引物，成功绘制了86份芥菜种质的DNA指纹图谱，平均每对引物可鉴别8.6份芥菜种质，与基于目的基因开发的Scot标记效率相当。综上所述，SRAP分子标记在芥菜种质资源DNA指纹图谱绘制和分子数据库的建立上具有较大的技术优势。本研究为芥菜种质资源的鉴别、知识产权保护和有效利用等提供了有效方法，具有较重要的理论和实践意义。

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