葡萄树伤流液培养基培养乳酸菌的研究

伊力哈木·托合迪，吕　乐，刘　玲，艾尔肯·依不拉音*

(1.新疆和田师范专科学校生物化学系，和田 848000；2.新疆医科大学药学院，乌鲁木齐 830011)



葡萄树伤流液培养基培养乳酸菌的研究

伊力哈木·托合迪1，吕乐2，刘玲2，艾尔肯·依不拉音2*

(1.新疆和田师范专科学校生物化学系，和田 848000；2.新疆医科大学药学院，乌鲁木齐 830011)

摘要：目的确定葡萄树伤流液作为乳酸菌培养基培养乳酸菌的适宜性。方法将葡萄树伤流液作为乳酸菌培养基培养乳酸菌，并对所培养的乳酸菌的产酸能力、生长特点和情况进行了初步研究。结果葡萄树伤流液含有丰富的营养物质，适宜作为乳酸菌的培养基，pH值为4.75时乳酸菌的生长情况优于pH值为4.48。葡萄树伤流液含有产酸能力强、耐酸、耐高温低温和稳定性高的乳酸菌。结论葡萄树伤流液营养丰富，作为乳酸菌培养基是适宜的，对伤流液中乳酸菌的培养可以提高体系的稳定性。

关键词：葡萄树伤流液；乳酸菌；稳定性

葡萄树伤流液是春季葡萄树处在发芽时间段从葡萄树植株的伤口处自然流出的无色、无味的纯净液体，其流量与葡萄树品种等因素有关[1]。研究结果显示，葡萄树伤流液具有很强的抗氧化性能，其抗氧化性可耐高温[2]。葡萄树伤流液抗氧化性的强弱与葡萄树的品种、产地等因素有关[3]。葡萄树伤流液含有丰富的营养物质，有17种游离的氨基酸、蛋白质以及多种矿物质[4-6]。这些营养物质为微生物的生长提供了丰富的营养。在一般条件下，葡萄树伤流液会在微生物的作用下很快发生变质。采用加热灭菌方法可以提高葡萄树伤流液的稳定性，但加热处理后仍有微生物活动存在，加热后40 d发生明显的变质现象[7]。而向葡萄树伤流液中添加沙枣树胶制备出的混合液具有很强的抑菌、灭菌性能[8]。一般沿着葡萄树流出的葡萄树伤流液中有多种微生物，这些微生物是影响葡萄树伤流液稳定性的主要因素，其中存在着有害菌和有益菌。在一定条件下，耐酸、耐高温的植物乳酸菌可以成为葡萄树伤流液中的优势菌。在葡萄树伤流液中培养乳酸菌能增强葡萄树伤流液的稳定性。在一些有害菌的作用下，葡萄树伤流液很容易氧化变质，乳酸菌是生产乳酸和生产抑菌物质的有益菌群，其中的植物乳酸菌是耐热菌种，生命力更强。添加有利于乳酸菌生长的物质，为乳酸菌成为优势菌创造条件，可以通过培养乳酸菌除去不利的微生物[9]。当葡萄树伤流液中的乳酸菌成为优势菌后，在乳酸菌生长过程中不断产生乳酸，所产乳酸的量足以使培养基pH值下降到葡萄树伤流液中蛋白质的等电点时，葡萄树伤流液中的蛋白质会沉淀出来，提高葡萄树伤流液的黏度[10]。此时可以制作出纯乳白色、具有较高黏度和稳定性高的纯天然葡萄树伤流液的植物乳酸菌产品。但对葡萄树伤流液研究时间短，特别是对葡萄树伤流液中所生长的微生物的性能还没有进行系统地研究，未能有效地解决葡萄树伤流液的变质等问题。本文介绍了向葡萄树伤流液中添加具有特定作用的物质使伤流液中的乳酸菌成为优势菌，利用葡萄树伤流液配制乳酸菌培养基的方法，对葡萄树伤流液培养基中乳酸菌的耐酸、耐高温、耐冷和发酵类型等性质进行研究。

1仪器与材料

1.1仪器SW-CS-F型超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；DHP-9162型电热恒温培养箱，上海秣马恒温设备厂；AEL-160型电子分析天平，日本岛津公司；PHS-3C型数显酸度计，雷磁分析仪器厂；橡皮筋，报纸，记号笔。

1.2材料葡萄树伤流液的收集：2013年4月上旬，在新疆和田市3年龄红葡萄园，剪去几根1年生枝条，用纯净水将葡萄树枝条洗净后，将枝条端插入到保鲜袋中，将其捆紧封闭，避免与空气直接接触。接收葡萄树伤流液，过滤后注入到塑料瓶中至满，密封，置于4 ℃冰箱中备用。

2方法

2.1葡萄树树胶的提取将剪下的葡萄树上生长3年的枝条，剥取外皮，剪成2 cm左右的枝条称取适量，用纯净水洗净，浸泡在纯净水中，72 h后，枝条上有白色树胶溢出，搅拌1 h左右使其溶解，捞取枝条，液体过滤得到微带乳白色的溶液。将此溶液放在恒温水浴锅中50 ℃恒温加热蒸发，得到乳白色片状的葡萄树树胶，置于4 ℃冰箱中备用。

2.2葡萄树伤流液培养基培养乳酸菌

2.2.1葡萄树伤流液乳酸菌培养基的配制(1)以高温高压处理葡萄树伤流液配制乳酸菌培养基。将贮存在冰箱中的葡萄树伤流液注入到121 ℃高压锅中，加热5 min，停止加热，冷却至室温后加入葡萄树树胶，使其在伤流液中的量达到5%。不断搅拌使葡萄树树胶溶解，生成均匀透明的溶液，向此溶液中添加适量柠檬酸使其pH值为4.48，为葡萄树伤流液乳酸菌培养基1。(2)在常温常压下葡萄树伤流液乳酸菌培养基的配制。将贮存在冰箱中的葡萄树伤流液放置在室温，温度为20 ℃，加入葡萄树树胶，使其在伤流液中的量达到5%。不断搅拌使葡萄树树胶溶解，生成均匀透明的溶液，向该溶液中加入适量的柠檬酸使其pH值为4.75，为葡萄树伤流液的乳酸菌培养基2。

2.2.2在葡萄树伤流液培养基中培养乳酸菌将葡萄树伤流液的乳酸菌培养基1和2分别置于4，25和40 ℃培养箱中培养乳酸菌。测定其在不同培养时间，各培养基pH值的变化情况。同时用紫外分光光度计在620 nm处，测量其不同培养时间培养基折光率的变化情况。

3结果

3.1葡萄树伤流液的一般理化特征新鲜的葡萄树伤流液是春季从葡萄树伤口自然流出的无色透明液体，新鲜纯净的葡萄树伤流液无色、无味。葡萄树伤流液的天然pH值为4.8～5.5。随着放置时间的延长，伤流液由无色透明转变为淡黄色，出现一定的异味，并产生出一定的絮状物质，pH值也逐渐上升，4 ℃下密封贮存1年的的葡萄树伤流液的pH值为6.40～6.95。每100 mL 葡萄树伤流液原液经冷冻干燥，可得白色晶状的干燥物质56 mg。

3.2葡萄树伤流液乳酸菌培养基的pH值变化在不同的温度下，测定葡萄树伤流液乳酸菌培养基1的pH值变化，结果见表1。

表1葡萄树伤流液乳酸菌培养基1的pH值变化

Tab.1 The pH changes of grape bleeding sap culture medium 1

温度/℃不同时间(d)的pH值024567910131622283440465244.464.384.354.343.823.603.513.473.423.383.343.323.313.303.303.28254.464.383.933.463.213.203.083.022.912.822.662.642.632.612.612.59404.464.404.384.344.294.244.204.164.094.053.993.923.873.823.793.76

由表1可知，高温加热葡萄树伤流液乳酸菌培养基后，将培养液分别置于温度为4，25和40 ℃的培养箱中进行培养时，培养基的pH值在不断地降低，培养液一直保持均匀稳定的状态。在温度为25 ℃时，乳酸菌的产酸速度最快，培养基1中乳酸菌在此温度时产酸能力最强，其次是4 ℃，在40 ℃时培养液的pH值的变化最慢。实验结果表明，葡萄树伤流液中有耐高温的乳酸菌，加适量酸和高温加热灭菌，除去有害菌后可为乳酸菌的生长创造有利条件。从温度对葡萄树伤流液中的乳酸菌产酸的影响来观察，葡萄树伤流液培养基1中存在耐冷和耐热乳酸菌，在较低温度4 ℃下能产酸，在40 ℃时也能产酸。因此，在4 ℃时葡萄树伤流液培养基1中耐冷乳酸菌为优势菌，乳酸菌作为有益菌通过乳酸和抑菌性物质的产生会增强培养液的稳定性。而处于40 ℃时葡萄树伤流液培养基1的酸度的变化最慢，稳定性最高，50 d后其pH值为3.76。从葡萄树伤流液培养基1中的乳酸菌产乳酸情况观察，葡萄树伤流液存在的乳酸菌种类多，即含有耐高温、耐酸、耐冷乳酸菌。葡萄树伤流液中乳酸菌的适应性很强，25 ℃时葡萄树伤流液培养基1中优势菌是耐冷乳酸菌。从酸性的变化幅度可以看出，常温产酸速度较慢，为了达到最小的pH值需要较长的时间，说明葡萄树伤流液培养基1在一般条件下具有较好的稳定性。利用此方法可以培养耐热、耐酸的乳酸菌，生产乳酸使其产生抑菌性物质来提高葡萄树伤流液的稳定性。利用此方法可以为葡萄树伤流液的开发利用创造条件。

在不同的温度下，测定葡萄树伤流液乳酸菌培养基2的pH值变化，结果见表2。

表2葡萄树伤流液乳酸菌培养基2的pH值变化

Tab.2 The pH changes of grape bleeding sap culture medium 2

温度/℃不同时间(d)的pH值024567910131622283440465244.754.703.823.803.783.683.623.363.353.343.142.932.832.772.752.74254.754.673.823.483.223.163.103.063.022.852.652.582.262.101.941.94404.754.723.903.753.573.493.423.343.283.193.162.912.762.612.562.45

由表2可知，在相同的温度下，葡萄树伤流液培养基2的pH值降低幅度比葡萄树伤流液培养基1的降低幅度大。由此说明，葡萄树伤流液培养基2中的乳酸菌的活性比葡萄树伤流液培养基1乳酸菌的活性高。温度对葡萄树伤流液培养基2的pH值的影响与培养基1是相同的，葡萄树伤流液培养基2的优势菌同样是耐冷乳酸菌。所配制的葡萄树伤流液培养基2中所生长的乳酸菌适应低温能力较强，这可能是由于葡萄树处在野外，温度较低，其树枝含有的菌种群适应低温所致。在室温25 ℃时葡萄树伤流液培养基2最终达到的最低pH值更小(相当于浓度为1 mol·L-1的乳酸菌的pH值为1.94)，说明其中乳酸菌的产酸能力和耐酸性更强。所生产乳酸的纯度较高，乳酸菌的发酵类型是同型发酵，利用本培养基可以生产纯度较高的乳酸。但葡萄树伤流液培养基2的稳定性比葡萄树伤流液培养基1的稳定性弱，培养基的衰亡速度较快。说明高温加热灭菌处理对葡萄树伤流液的稳定性是有利的。

3.3葡萄树伤流液乳酸菌培养基中的乳酸菌生长情况不同的温度下，葡萄树伤流液乳酸菌培养基1中的乳酸菌生长情况，见表3。

表3葡萄树伤流液乳酸菌培养基1的乳酸菌生长情况

Tab.3 The lactic acid bacteria growth condition of grape bleeding sap culture medium 1

温度/℃不同时间(d)的折光率024567910131622283440465240.0380.0750.1180.1320.1680.1920.2040.2220.2390.2580.2750.2960.3160.3410.3670.394250.0380.3660.3800.3850.3950.4050.4130.4180.4250.4350.4530.4110.3550.2930.2660.209400.0380.0620.0780.0920.1080.1250.1470.1550.1470.1360.1310.1270.1190.1120.1070.099

由表3可知，葡萄树伤流液培养基1在25 ℃时，乳酸菌生长的延迟期和对数期都较短，培养基配制后乳酸菌就开始生长，其生长很快就进入对数期，且在48 h内就完成乳酸菌生长的对数期。25 ℃时，在葡萄树伤流液培养基1中乳酸菌生长的稳定期和衰亡期都较长，为20 d。说明葡萄树伤流液培养基是较稳定的体系。葡萄树伤流液培养基1达到生长稳定期时乳酸菌的数量较少，但是衰亡期和稳定期都较长，稳定性更强。说明高温加热处理葡萄树伤流液时，葡萄树伤流液中菌种及营养物质的部分消耗使乳酸菌的数量和生长受到了影响，同时加热除去更多的有害菌，提高了培养基的稳定性。4 ℃时，培养基1中乳酸菌的生长速度明显变慢。温度高于40 ℃时，不利于葡萄树伤流液中乳酸菌的生长。由此说明，葡萄树伤流液培养基1中乳酸菌是以耐冷菌为主，其最高生长温度低于40 ℃。但是，高温处理葡萄树伤流液后乳酸菌在室温或较高的温度下生长和衰亡速度都慢，而稳定性较高，可以利用此方法提高葡萄树伤流液的稳定性。

不同的温度下，葡萄树伤流液乳酸菌培养基2中的乳酸菌生长情况，见表4。

表4葡萄树伤流液乳酸菌培养基2的乳酸菌生长情况

Tab.4 The lactic acid bacteria growth condition of grape bleeding sap culture medium 2

温度/℃不同时间(d)的折光率024567910131622283440465240.0280.0850.1180.3100.4700.4920.5030.5140.5310.5580.5980.5860.2160.1310.0970.077250.0280.2090.4290.4750.5190.5500.5650.5680.5750.5920.6840.6120.5950.3330.2980.015400.0280.0460.0990.1030.1250.1320.1370.1250.1120.0860.0620.0410.0340.0250.0190.016

由表4可知，培养基2中乳酸菌生长延迟期比培养基1长，生长的对数期较短，达到最高菌数所需要的时间相同，而培养基2中乳酸菌衰亡期更短。说明培养基2的稳定性低于培养基1的稳定性，由此说明，加热处理可以提高葡萄树伤流液的稳定性。比较表3和表4中乳酸菌数量的最高值可以看出，培养基2中乳酸菌的数量高于培养基1中乳酸菌的数量，说明加热处理使伤流液中营养物质和乳酸菌的数量减少，培养基中乳酸菌的数量会受到影响。从温度对培养基1和2中乳酸菌生长的影响来看，在低温培养基2中的生长更快，显示菌数量、菌品种更多。说明没有加热时伤流液中乳酸菌在低温环境中生长更快，葡萄树伤流液中的乳酸菌更适宜在低温环境中生长，但其稳定性较弱。

4讨论

乳酸菌被认为是GRAS(Generally recognized as safe)类细菌，能够产生多种抗菌物质。在饲料[11]、食品[12]、饮品[13]等中作为添加组分，有促进生长发育、抗菌等作用。葡萄树伤流液中的营养物质及其抗氧化性为厌氧乳酸菌的生长创造了良好的环境。葡萄树伤流液培养基中的乳酸菌耐酸、耐高温、耐低温，也可以在室温下生长。说明葡萄树伤流液中可以生长种群多的乳酸菌，且适应性很强。因此，葡萄树伤流液中的乳酸菌在一定条件下很容易成为优势菌群，这就为葡萄树伤流液及其中乳酸菌的广泛应用奠定了基础。

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Study on the lactic acid bacteria cultured by grapevine bleeding sap medium

Ilham TOHTI1，LÜ Le2，LIU Ling2，Arkin IBURAIM2*

(1.Department of Biochemistry，Hotan Teachers College，Hotan 848000，China；2.College of Pharmacy，Xinjiang Medical University，Urumqi 830011，China)

Abstract:ObjectiveTo determine the suitability of grapevine bleeding sap as a medium for culturing lactic acid bacteria. MethodsGrape bleeding sap was used as a medium of lactic acid bacteria. Then the ability of producing acid，growth characteristics and conditions were assessed. ResultsGrapevine bleeding sap contained rich nutrients. And it was suitable as a culture medium of lactic acid bacteria. At pH 4.75，the growth condition of lactic acid bacteria was better than at pH 4.48. Grapevine bleeding sap contained lactic acid bacteria，which had the ability to produce acid，good thermostability and high stability. The major lactic acid bacteria was the low cold bacteria. ConclusionGrapevine bleeding sap contained abundant nutritions. It was suitable to be used as a medium to culture lactic acid bacteria. And the stability of the grapevine bleeding sap could be improved in this way.

Key words:grapevine bleeding sap；lactic acid bacteria；stability

(收稿日期：2015-09-26)

中图分类号：R944

文献标志码：A

文章编号：1004-2407(2016)03-0288-05

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2016.03.020

*通信作者：艾尔肯·依不拉音，男，教授，博士生导师

作者简介：伊力哈木·托合迪，男，副教授

基金项目：国家自然科学基金项目(编号:21162030)