柚皮苷对gp120所致BV2小胶质细胞损伤的保护作用*

陈强，秦姗姗，刘成龙，徐昌水

（南昌大学基础医学院生理学教研室，江西南昌330006）



柚皮苷对gp120所致BV2小胶质细胞损伤的保护作用*

陈强，秦姗姗，刘成龙，徐昌水

（南昌大学基础医学院生理学教研室，江西南昌330006）

摘要：目的探讨P2X7受体在HIV-1包膜糖蛋白gp120所致BV2小胶质细胞损伤中的作用，以及柚皮苷通过作用于P2X7受体对gp120所致BV2小胶质细胞损伤产生的保护作用。方法通过gp120处理BV2小胶质细胞建立细胞损伤模型，并通过MTS比色法检测细胞损伤程度和柚皮苷是否对损伤细胞具有保护作用；应用逆转录PCR（RT-PCR）及蛋白质印迹法（Western blot）检测P2X7受体的表达变化。结果gp120处理24 h后，与对照组比较，gp120组细胞存活率显著下降（P<0.01）；gp120+柚皮苷组的细胞存活率与gp120组比较有所上升（P<0.01），但与gp120+BBG组比较差异无统计学意义（P>0.05）；RT-PCR及Western blot的检测结果显示，gp120组小胶质细胞的P2X7受体mRNA及蛋白均比对照组明显升高（P<0.01），而gp120+柚皮苷组与gp120组比较有所下降（P<0.01）。结论P2X7受体参与gp120所致BV2小胶质细胞损伤，柚皮苷可能通过抑制P2X7受体的表达上调对gp120所致细胞损伤产生保护作用。

关键词：艾滋病痴呆；BV2小胶质细胞；柚皮苷；gp120；P2X7受体

人类免疫缺陷病毒感染引起的艾滋病脑病，又称为AIDS痴呆综合征（AIDS-dementia complex，ADC）[1]，主要临床表现为患者的学习和记忆能力缺陷，其具体机制尚不清楚[2]。ADC的病情与免疫抑制程度相关，其中巨噬细胞和小胶质细胞的活化是ADC发生的关键[3]，其活化产生的多种有害物质对中枢神经系统内的其他细胞产生损害或导致细胞凋亡[4]。有研究发现，嘌呤2X7（Purinergic 2X7，P2X7）受体在调节小胶质细胞功能活动中具有重要作用，三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）作为小胶质细胞功能信号分子，可通过激活P2X7受体活化小胶质细胞，进而释放炎性因子并导致神经细胞慢性炎症反应，最终表现神经毒性作用[5-6]。结合P2X7受体涉及炎症及免疫反应，并与神经退行性疾病密切相关，P2X7受体可能成为ADC防治的新靶点。柚皮苷是一类天然黄酮类物质，具有抗炎、抗氧化应激、糖脂代谢调节和心肌保护等作用[7]，提示柚皮苷可能对ADC有一定的治疗效果。本研究通过建立小胶质细胞损伤模型，在细胞水平上探究柚皮苷是否对gp120所致小胶质细胞损伤起到保护作用，对扩宽柚皮苷的应用范围和探索潜在ADC的治疗手段等方面具有极其重要意义。

1　材料与方法

1.1主要材料及试剂

实验细胞：BV2小胶质细胞（GDC0311），由中国典型培养物保藏中心提供。

试剂：DMEM高糖培养基（美国HyClone公司），胎牛血清、总RNA提取试剂盒（北京全式金生物技术有限公司），gp120、柚皮苷及亮蓝G（brilliant blue G，BBG）（美国Sigma公司），羊抗兔P2X7抗体（英国Abcam公司），羊抗小鼠β-actin抗体、二抗-羊抗兔IgG、二抗-羊抗小鼠IgG（北京中杉金桥生物技术有限公司），正反向引物（上海生物工程有限公司），细胞增殖检测试剂盒（美国Promega公司），ECL发光液、RNA逆转录试剂盒（美国Thermo公司），NO检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）。

1.2细胞培养与实验分组

以冷冻保存复苏后的细胞为第一代，所用培养基为DMEM高糖完全培养基（含10%胎牛血清，1%双抗），传代比例为1∶6，3～4 d传一代，待细胞传3 到4代稳定后即可用于实验，所有实验操作所用的细胞均控制在30代以内。实验分为对照组、gp120模型组（gp120）、柚皮苷处理组（gp120+柚皮苷）和P2X7受体拮抗剂BBG处理组（gp120+BBG）4组，除对照组外，其余各组均给予2.0 μg/L gp120处理24h，其中gp120+柚皮苷组和gp120+BBG组分别同时给予柚皮苷（80μm/L）和BBG（50μm/L）处理24 h。接种孔板后，待细胞生长到70%～80%左右时即可行药物干扰，其中gp120用无菌水溶解，柚皮苷用DMSO溶解，BBG用PBS缓冲液溶解，所有药物用DMEM高糖基础培养基稀释。

1.3MTS比色法测细胞活性

待培养瓶中的细胞生长到80%～90%左右时，进行细胞传代。离心后用2 ml DMEM高糖完全培养基重悬细胞，进行细胞计数。吸取适量体积细胞悬液用完全培养基稀释，充分混匀后使细胞密度约为1×105/ml，边摇晃边加入到96孔板中，每孔100μl。待细胞生长到60%左右时更换含有药物的基础培养基处理24 h。MTS储存液按1∶10的比例用基础培养基稀释，处理24 h后进行细胞换液，每孔加入100μl MTS稀释液，37℃培养箱（5%二氧化碳CO2）孵育4 h，490 nm检测每孔的吸光值（absorbance，Abs），各组细胞存活率以Abs值大小表示。

1.4一氧化氮NO检测

用24孔板接种细胞，接种密度约为1×105/ml，每组做3个平行复孔。加药处理24 h后，取各组细胞上清液，根据一氧化氮NO检测试剂盒测定各组BV2小胶质细胞上清液中的一氧化氮NO含量。结果通过多功能酶标仪读取Abs值，再根据试剂盒所给的公式计算得出。

1.5逆转录PCR（reverse transcription-PCR，RT-PCR）技术测定P2X7mRNA

表1　P2X7及β-actin mRNA的引物序列

用6孔板接种细胞，细胞密度约为1×106/ml。药物处理24 h后，用总RNA提取试剂盒提取细胞RNA，再通过逆转录试剂盒逆转录为cDNA，用预先设计的正反向引物。见表1。通过RT-PCR法检测各组P2X7mRNA的表达情况，PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分析。实验结果通过BIO-RAD凝胶成像仪观察，采用Image Lab凝胶成像系统软件读取电泳条带的斑点密度扫描值，与其对应的肌动蛋白β-actin条带的比值作为P2X7mRNA表达的相对水平量。

1.6蛋白质印迹法（Western blot）检测P2X7蛋白

药物处理24 h后，用RIPA裂解液裂解细胞，提取细胞总蛋白。经SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，转膜、封闭后孵育一抗（P2X7比例为1∶1 000，4℃孵育过夜；β-actin比例为1∶800，常温孵育2 h），经洗膜后孵育二抗（比例为1∶2 000，常温孵育1 h），再经洗膜后通过BIO-RAD凝胶成像仪曝光显影。结果采用Image-Pro Plus 6.0分析软件读取目的条带的光密度值，与其对应的β-actin条带的比值作为P2X7蛋白表达的相对水平量。

1.7统计学方法

采用SPSS 21.0统计软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，实验中计量资料用单因素方差分析和LSD-t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1柚皮苷提高gp120所致BV2小胶质细胞的存活率

药物处理24 h后，各组细胞通过多功能酶标仪读取Abs值。以Abs值大小代表各组细胞的存活率，经方差分析比较差异有统计学意义（F3，24=4.385，P =0.016）。进一步分析发现，gp120组细胞存活率与对照组比较明显降低，差异有统计学意义（P= 0.002），提示gp120对BV2小胶质细胞有一定的损伤作用；与gp120组比较，gp120+柚皮苷组（P=0.041）和gp120+BBG组（P=0.046）的细胞存活率有所上升，差异有统计学意义，而gp120+柚皮苷组与gp120+ BBG组比较差异无统计学意义（P=0.962），提示柚皮苷对gp120所致BV2小胶质细胞损伤有一定的保护作用。见表2。

表2　MTS比色法检测各组细胞存活率（±s）

表2　MTS比色法检测各组细胞存活率（±s）

注：1）与对照组比较，P<0.01；2）与gp120组比较，P<0.05

组别　　样本数　Abs值对照组　7　0.91±0.10 gp120组　7　0.71±0.091）gp120+柚皮苷组　7　0.83±0.102）gp120+BBG组　7　0.82±0.122）

2.2BV2小胶质细胞上清液中一氧化氮NO的含量

通过酶标仪读取各组Abs值后，再根据一氧化氮NO检测试剂盒中的公式计算得出各组细胞上清液中一氧化氮NO的含量，结果显示，对照组、gp120组、gp120+柚皮苷组和gp120+BBG组BV2小胶质细胞一氧化氮NO的含量分别为：（23.15±2.47）、（39.76±3.77）、（27.86±4.60）和（29.93±4.34）μm/L。经方差分析比较差异有统计学意义（F3，16=9.704，P= 0.005）。进一步分析发现，gp120组一氧化氮NO含量明显高于对照组（P=0.001）、gp120+柚皮苷组（P= 0.006）和gp120+BBG组（P=0.015），而gp120+柚皮苷组与gp120+BBG组比较差异无统计学意义（P= 0.532）。见图1。

2.3柚皮苷抑制gp120所致BV2小胶质细胞P2X7mRNA的表达上调

各组细胞提取总RNA后，用RT-PCR法检测BV2小胶质细胞P2X7mRNA的表达。结果显示，对照组、gp120组、gp120+柚皮苷组和gp120+BBG组BV2小胶质细胞P2X7mRNA的相对表达量分别为：（0.73±0.06）、（1.05±0.06）、（0.78±0.05）和（0.81±0.04）。经方差分析比较差异有统计学意义（F3，16=35.478，P=0.000）。进一步分析发现，gp120组P2X7mRNA的表达明显高于对照组（P=0.000），提示gp120能诱导BV2小胶质细胞P2X7mRNA的表达上调；与gp120组比较，gp120+柚皮苷组（P = 0.000）和gp120+BBG组（P=0.000）的表达均明显降低，而gp120+柚皮苷组与gp120+BBG组比较差异无统计学意义（P=0.480）。该统计结果提示，柚皮苷能抑制gp120诱导BV2小胶质细胞P2X7mRNA的表达上调。见图2。

图1　各组BV2小胶质细胞上清液中一氧化氮NO的含量

2.4柚皮苷降低gp120诱导BV2小胶质细胞P2X7受体蛋白的表达上调

各组细胞提取总蛋白后，用Western blot方法检测BV2小胶质细胞P2X7受体蛋白表达的相对水平量。结果显示，对照组、gp120组、gp120+柚皮苷组和gp120+BBG组P2X7受体蛋白的相对表达量分别为：（0.46±0.04）、（0.79±0.04）、（0.38±0.07）和（0.42±0.06）。经方差分析比较差异有统计学意义（F3，16=61.995，P=0.000）。进一步分析发现，gp120组P2X7受体蛋白的表达明显高于对照组（P=0.000），表明gp120能诱导BV2小胶质细胞P2X7受体蛋白的表达上调；与gp120组比较，gp120+柚皮苷组（P= 0.000）和gp120+BBG组（P=0.000）的表达均明显降低，而gp120+柚皮苷组与gp120+BBG组比较差异无统计学意义（P=0.269），表明柚皮苷对gp120诱导BV2小胶质细胞P2X7受体蛋白的表达上调具有抑制作用。见图3。

图2　RT-PCP法检测各组BV2小胶质细胞P2X7mRNA的表达情况

图3　Western blot法检测各组BV2小胶质细胞P2X7受体蛋白的表达情况

3　讨论

目前，ADC的具体机制尚不清楚，临床上也没有特效的治疗药物[8]。有研究认为，HIV或呈游离状态或借助感染的免疫细胞，跨过血脑屏障或血脑脊液屏障进入中枢神经系统，间接引起ADC等神经退行性疾病[9]。HIV-1包膜糖蛋白gp120在病毒包膜与宿主细胞表面受体识别与结合等方面有重要作用[10]，并通过巨噬细胞和小胶质细胞产生炎症细胞因子和类花生酸类物质等神经毒素，造成细胞损伤和干扰神经递质功能，进而影响到患者的学习和记忆能力，引起记忆缺陷[11]。因此，由gp120间接引起的脑内巨噬细胞和小胶质细胞活化在ADC等神经退行性疾病中扮演重要角色[12-13]。实验中发现，gp120组细胞存活率明显低于对照组，表明gp120能够对BV2小胶质细胞产生损伤作用。而gp120+BBG组细胞存活率与对照组比较无明显差异，表明P2X7受体在gp120所致细胞损伤中发挥一定的作用，可能因损伤细胞所释放出的ATP通过P2X7受体激活小胶质细胞，活化后的小胶质细胞又以自分泌的形式将ATP刺激信号级联放大，从而使小胶质细胞过度激活，使其失去离子选择性，导致细胞离子通透性改变，进而引起细胞死亡[14-15]。

P2X7受体在调节小胶质细胞功能活动中具有重要作用[16]。小胶质细胞表达P2X7受体，其生理功能呈多样性，包括过氧化物和一氧化氮NO的生成、T细胞的激活和成熟、炎症因子产生等[17]。有研究发现，P2X7受体可通过激活MAPK或其他信号通路，介导细胞对胞外增殖、分化和死亡等信号的长时程反应[18]。实验结果显示，gp120组的P2X7mRNA和受体蛋白表达均高于对照组，表明gp120能诱导BV2小胶质细胞P2X7mRNA和受体蛋白的表达上调，提示gp120有可能通过P2X7受体介导的信号通路引起细胞损伤或死亡。通过细胞活性检测发现，gp120+柚皮苷组的细胞存活率较gp120组有所上升，说明柚皮苷对gp120所致细胞损伤具有保护作用，结合柚皮苷具有抗炎、抗氧化应激等特性，提示柚皮苷可能对HIV引起的ADC有一定的缓解作用。同时，gp120+柚皮苷组和gp120+BBG组的细胞存活率类似，结合RT-PCR及Western blot实验结果，推测柚皮苷可能在基因转录和蛋白翻译水平抑制gp120诱导的P2X7受体表达上调而对细胞的损伤产生保护作用。一氧化氮NO检测结果发现，除对照组外，其余3组经gp120处理的细胞一氧化氮NO水平均有所上升，与活化后的小胶质细胞释放一氧化氮NO等有害因子对细胞产生毒害作用相类似[19]。结合柚皮苷和BBG对gp120诱导细胞释放一氧化氮NO具有类似的抑制作用，推测柚皮苷对gp120所致细胞损伤产生的保护作用可能与抑制一氧化氮NO的释放有关。

总之，gp120可通过诱导P2X7受体的表达上调造成细胞损伤，柚皮苷对P2X7受体介导的细胞损伤有一定的保护作用。但这种损伤或保护作用的具体机制还有待研究，如gp120是否通过P2X7介导的细胞信号通路呈递其损伤作用，柚皮苷是否通过参与白介素1β、肿瘤坏死因子α等炎症因子的调节或作用于细胞信号通路方面来发挥对细胞的保护作用等诸多问题还有待解决。本实验在细胞水平上研究ADC等神经退行性疾病的可能性机制，对将来探索ADC的治疗手段及新型治疗药物的发掘等方面具有极其重要意义。

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（张蕾编辑）

论著

Protective effect of naringin on gp120-induced injury in BV2 microglial cells*

Qiang Chen, Shan-shan Qin, Cheng-long Liu, Chang-shui Xu
(Department of Physiology, Basic Medical Sciences College of Nanchang University, Nanchang, Jiangxi 330006, China)

Abstract:Objective To explore the effect of P2X7receptor on HIV-1 envelope glycoprotein gp120 (gp120)-induced injury in BV2 microglial cells, and research the protective effect of naringin on gp120-induced injury mediated by P2X7receptor in BV2 microglial cells. Methods BV2 microglial cell injury model was established by gp120 treatment; The damage degree of BV2 microglial cells and the protective effect of naringin were measured by MTS colorimetry. The expression changes of P2X7receptors were detected by RT-PCR and Western blot. Results Compared with Ctrl group, the cell survival rate of gp120 group decreased significantly after 24-h treatment (P < 0.01). The cell survival rate of gp120 + naringin group increased compared with gp120 group (P < 0.01), while there was no difference compared with gp120 + BBG group (P > 0.05). The results of RT-PCR and Western blot showed that the expression of P2X7mRNA and protein in gp120 group was increased significantly compared with Ctrl group (P < 0.01), and it was decreased in gp120 + naringin group compared with gp120 group (P < 0.01). Conclusions P2X7receptor involved in gp120-induced injury in BV2 microglial cells, and naringin may play a protective effect on gp120-induced injury by inhibiting the up-regulation of P2X7receptor expression.

Keywords:AIDS-Dementia complex; BV2 microglial cells; naringin; gp120; P2X7receptor

[通信作者]徐昌水，E-mail：xuchangshui@ncu.edu.cn；Tel：0791-86360556，13320117233

*基金项目：国家自然科学基金课题（No：81260187）；江西省青年科学家（井冈之星）培养对象计划项目（No：20153BCB23033）；江西省研究生创新专项资金项目（No：YC2015-S040，YC2014-S098）

收稿日期：2015-12-28

文章编号：1005-8982（2016）08-0001-06

DOI:10.3969/j.issn.1005-8982.2016.08.001

中图分类号：R338.2

文献标识码：A