儿茶中表儿茶素提取工艺研究

孙　黎，周　娟，徐自奥，李晓祥

(1.安徽中医药大学药学院，安徽 合肥　230012；2.合肥迈可罗生物工程有限公司，安徽 合肥　230071)



·方药研究·

儿茶中表儿茶素提取工艺研究

孙黎1，周娟2，徐自奥2，李晓祥2

(1.安徽中医药大学药学院，安徽 合肥230012；2.合肥迈可罗生物工程有限公司，安徽 合肥230071)

[摘要]目的优选儿茶中有效成分表儿茶素的提取工艺。方法以甲醇为流动相A，以0.04 mol/L柠檬酸溶液-N,N-二甲基甲酰胺(45∶8)为流动相B，在phenomenex C(18)柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)上进行等度洗脱，容积比为15∶85。柱温：35 ℃;流速：1.0 mL/min;检测波长：280 nm;进样量20 μL。以干膏得率和表儿茶素提取率为考察指标，考察提取溶剂、提取温度、提取次数和提取时间等因素，采用正交试验优选最佳提取工艺。结果优选工艺为药材加10倍量甲基叔丁基醚，70 ℃回流提取2次，每次1.0 h。结论优选所得的工艺稳定可行，可作为儿茶中表儿茶素的提取工艺。

[关键词]儿茶；表儿茶素；提取工艺；优化

儿茶为传统中药，2010年版《中华人民共和国药典》一部收载的儿茶为豆科植物儿茶Acaciacatechu(L.f.)Willd.去皮枝干的干燥煎膏[1]。中药复方如儿茶配方颗粒[2]、复方儿茶止泻膜剂[3]、茶黄酊[4]、跌打活血散[5]等中均含有儿茶。现代药理研究表明，儿茶中有效成分表儿茶素具有抗菌[6]、抗凋亡[7]、抗病毒[8]和抗氧化[9]等作用。目前文献[10]主要关注于表儿茶素的含量测定，未对儿茶中表儿茶素的提取工艺进行研究。本研究以干膏得率和表儿茶素提取率为检测指标，采用反相高效液相色谱法测定儿茶药材中表儿茶素的含量，优选了儿茶中表儿茶素的提取工艺，为进一步的工业化生产提供实验依据。

1仪器与试药

1.1仪器岛津LC-20AD高效液相色谱仪：日本岛津公司；HS10260D型超声清洗器：天津奥特赛恩斯仪器有限公司；BP211D型十万分之一电子天平：德国赛多利斯公司；RE-52CS旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂；PHS-25型pH计：上海雷磁仪器厂。

1.2试药表儿茶素(批号 110878-200102)对照品：由中国药品生物制品检定所提供。儿茶药材：由安徽海鑫中药饮片有限公司提供，产地云南，经安徽中医药大学第一附属医院孟楣主任中药师鉴定为豆科植物儿茶Acaciacatechu(L.f.)Willd的去皮枝干所得的干燥煎膏；甲醇为色谱纯，甲基叔丁基醚、亚硫酸钠、柠檬酸和N,N-二甲基甲酰胺：均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司；水为超纯水。

2方法和结果

2.1高效液相色谱法测定表儿茶素含量

2.1.1色谱条件以Phenomenex C18为色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；以甲醇为流动相A， 0.04 mol/L柠檬酸溶液-N,N-二甲基甲酰胺(45∶8)为流动相B，按流动相A-流动相B(15∶85)的比例进行等度洗脱；柱温35 ℃，检测波长280 nm，进样量20 μL，流速1.0 mL/min。

2.1.2色谱条件及系统适用性试验在上述色谱条件下，取儿茶素提取物固体粉末适量，加50%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，经0.45 μm滤膜过滤，取续滤液20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图。结果显示，儿茶提取物中表儿茶素与其他组分色谱峰可实现基线分离且无干扰，理论塔板数以表儿茶素计大于6 000。对照品和儿茶提取物的色谱图见图1。

2.1.3对照品溶液的制备及线性关系精密称取表儿茶素对照品4.3 mg，加甲醇溶解并稀释制成质量浓度为172.0 μg/mL的对照品贮备液，置4 ℃冰箱中冷藏备用。分别取表儿茶素对照品贮备液2.5、5.0、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0 μL注入液相色谱仪，以表儿茶素的峰面积积分值(y)为纵坐标，浓度(x)为横坐标绘制标准曲线，表儿茶素的线性回归方程分别为：y=180.83x+1.687，R2=0.999 9。结果表明，表儿茶素进样量在0.43～8.6 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.1.4供试品溶液的制备及测定精密称取儿茶提取物固体粉末12.5 mg，置25 mL容量瓶中，加50%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液，经0.45 μm滤膜过滤，取续滤液20 μL注入液相色谱仪，记录表儿茶素的峰面积。按表儿茶素标准品线性方程计算提取物中表儿茶素含量。

图1表儿茶素对照品(A)和儿茶提取物(B)的高效液相色谱图

2.2单因素提取工艺的考察

2.2.1提取溶剂的选择取儿茶药材4份，每份10.0 g，分别加入乙醇、乙酸乙酯、二氯甲烷和甲基叔丁基醚4种极性由强到弱的溶剂200 mL，浸渍30 min，在N2保护下，70 ℃加热回流提取1.0 h，过滤，用旋转蒸发仪旋去滤液中溶剂，将所得黏稠物倾入蒸发皿，真空干燥至恒质量，得固体无定形粉末。按“2.1.4”项下方法配制供试品溶液，注入液相色谱仪，根据峰面积计算表儿茶素提取率，结果见表1。

表1　提取溶剂对表儿茶素提取率的影响

由表1可知，在4个不同极性溶剂(乙醇、乙酸乙酯、二氯甲烷和甲基叔丁基醚)中，强极性乙醇提取出的成分最少，干膏得率仅为5.4%，对表儿茶素的提取率也较低，仅为31.1%。而弱极性甲基叔丁基醚提取出的成分最多，干膏得率为22.1%，表儿茶素的提取率也最高，为47.7%。从外观上观察，药材采用乙醇及甲基叔丁基醚提取获得的产品均为淡红色粉末，且带有一定程度的光泽；而采用乙酸乙酯及二氯甲烷提取后的提取物均为淡褐色粉末，有颗粒感，光泽较差，因此选择儿茶药材的提取溶剂为甲基叔丁基醚。

2.2.2提取温度的选择取儿茶药材3份，每份10.0 g，均加入甲基叔丁基醚200 mL，浸渍30 min，在N2保护下，分别在60 ℃、70 ℃及90 ℃水浴中回流提取1.0 h，过滤，用旋转蒸发仪旋去滤液中溶剂，将所得黏稠物倾入蒸发皿，真空干燥至恒质量，得固体无定形粉末。按“2.1.4”项下方法配制供试品溶液，注入液相色谱仪，根据峰面积计算表儿茶素提取率，结果见表2。表明儿茶药材在90 ℃提取干膏得率最高，但对表儿茶素的提取与70 ℃相比有所下降，且提取物颜色与70 ℃相比也较深，显示在90 ℃环境下提取其终产品杂质含量较高，因此初步选择70 ℃为儿茶药材的提取温度。

表2　提取温度对甲基叔丁基醚提取

2.3正交试验优化提取工艺在单因素考察实验的基础上，选择料液比(A)、提取温度(B)、提取时间(C)和提取次数(D)为考察因素，按L9(34)进行正交试验，对儿茶药材的提取工艺进行优化。因素水平见表3。该正交试验以干膏得率和表儿茶素提取率为检测指标，并辅以提取物外观色泽等考察因素，采用综合评分法进行数据统计分析，结果见表4。综合得分=干膏得率×30%+表儿茶素提取率×70%。对正交试验结果进行方差分析，结果见表5。

表3　L9(34)正交试验因素水平表

表4　 L9 (34)正交试验结果

表5　正交试验方差分析表

由上述极差分析结果可知，各因素对实验的影响程度大小顺序为A>D>B>C；由方差分析结果可知，提取次数对表儿茶素提取率影响最大。结合工艺成本考虑，确定表儿茶素的最佳提取工艺为A2B2C2D2，即药材加入10倍量甲基叔丁基醚，浸渍30 min，在N2保护下，70 ℃加热回流提取2次，每次1.0 h。

2.4验证试验根据正交试验结果所得最佳工艺条件，分别提取3批儿茶药材进行验证，具体操作：取儿茶药材约200 g，加入10倍量的甲基叔丁基醚，浸渍30 min，在N2保护下，70 ℃加热回流提取1.0 h，过滤，将滤渣加入约10倍量的甲基叔丁基醚，在N2保护下，70 ℃加热回流继续提取1.0 h，过滤，合并两次滤液，用旋转蒸发仪旋去滤液中溶剂，将所得黏稠物倾入蒸发皿，真空干燥至恒质量，得固体无定形粉末，同法制备3份。以干膏得率和表儿茶素提取率为检测指标，并辅以提取物外观色泽等考察因素，对该提取工艺进行验证。结果显示，采用该工艺提取的儿茶药材中表儿茶素各项指标良好。结果见表6。

表6　表儿茶素提取工艺验证结果

3讨论

为寻找合理可行的儿茶中表儿茶素提取工艺条件，笔者首先进行了提取溶剂与提取时间的单因素考察。在对提取溶剂的考察中，选取了4种不同极性溶剂(乙醇、乙酸乙酯、二氯甲烷和甲基叔丁基醚)，其中极性最强的乙醇提取出的表儿茶素得率最少；弱极性的甲基叔丁基醚提取出的表儿茶素得率最高，显示甲基叔丁基醚可实现对儿茶中的表儿茶素进行选择性提取。这可能是由于醚类溶剂与表儿茶素易产生氢键作用，且表儿茶素分子中也存在醚键结构，符合相似相溶原理所致。因此选择甲基叔丁基醚为表儿茶素的提取溶剂。而在对提取温度的考察中，温度越高越有利于表儿茶素的提取，但升至90 ℃时，虽然干膏得率最高，但也伴随着表儿茶素提取率的下降，产品外观也呈淡褐色，缺少光泽，考虑工业化提取的经济能耗，70 ℃较适宜于表儿茶素的提取。

笔者从料液比、提取次数、提取时间和提取温度4个因素入手，运用4因素3水平的正交设计及高效液相色谱分析手段，以干膏得率和表儿茶素提取率为分析指标，探索出儿茶中表儿茶素的最佳提取工艺条件。并对最佳工艺进行了3批次的验证，结果显示对儿茶中表儿茶素的提取重现性良好，各项指标符合要求。

虽然笔者能获得较高的提取率，但粗产品中均含有一定量杂质，造成产品纯度不高，为表儿茶素的后期药理实验带来不便。因此笔者采用通用的柱层析方法对表儿茶素进行纯化，洗脱程序如下：将干膏粉适量干法上硅胶柱，先以石油醚-乙酸乙酯(15∶1)洗脱3倍柱体积，再将洗脱液的容积比更换为10∶1，洗脱4倍柱体积，接着将洗脱剂的容积比更换2∶1，洗脱2倍柱体积，最后开始收集洗脱液，旋去溶剂后，真空干燥至恒质量，得淡粉色粉末。产品用甲醇溶解后，经高效液相色谱法分析，表儿茶素纯度可达98%。

综上所述，本研究通过优化获得儿茶中表儿茶素的最佳提取工艺条件为：在70 ℃水浴中，按料液比1∶10加入溶剂甲基叔丁基醚，共提取2次，每次1.0 h。笔者采用柱层析手段获得了高纯度的表儿茶素样品，为工业化生产提供实验依据。

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Optimization of Extraction Process for Epicatechin in Catechu

SUNLi1,ZHOUJuan2,XUZi-ao2,LIXiao-xiang2

(1.SchoolofPharmacy,AnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230012,China; 2.HefeiMicrobiologicalEngineeringCo.,Ltd.,AnhuiHefei230071,China)

[Abstract]ObjectiveTo optimize the extraction process for epicatechin, which is an effective component of Acacia catechu (L.) Wild. MethodsWith methanol as mobile phase A and 0.04 mol/L citric acid solution-N, N-dimethylformamide (V/V=45∶8) as mobile phase B, isocratic elution was performed on the phenomenex C(18) column (4.6 mm×250 mm, 5 μm) at a volume ratio of 15∶85, a column temperature of 35 ℃, a flow rate of 1.0 mL/min, a detection wavelength of 280 nm, and a sample volume of 20 μL. Dry extract yield and the extraction rate of epicatechin were selected as the assessment indices to determine the optimized process (extraction solvent, extraction temperature, times of extraction, and extraction duration) by an orthogonal test. ResultsIn the optimized process, catechu was mixed with methyl tertiary butyl ether (10 times), and reflux extraction was performed at 70 ℃ twice (1 h each time). ConclusionThe optimized process is stable and feasible and can be used as the extraction process for epicatechin in Acacia catechu (L.) Wild.

[Key words]Acacia catechu (L.) Wild; Epicatechin; Extraction process; Optimization

(收稿日期：2015-11-19；编辑：曹健)

[中图分类号]R284.2[DOI]10.3969/j.issn.2095-7246.2016.02.025

通信作者：李晓祥，45871118@qq.com

作者简介：孙黎(1981-)，女，硕士，讲师

基金项目：安徽省对外合作科技项目(1403062024)；安徽省自然科学基金项目(1508085QH194)