抵当汤对糖尿病大鼠心肌组织JAK2/STAT3信号通路的影响

张　凯，储全根，毕华剑，刘新萍，吴元洁，周雪梅，刘德胜，董妍妍

(安徽中医药大学，安徽 合肥　230012)



抵当汤对糖尿病大鼠心肌组织JAK2/STAT3信号通路的影响

张凯，储全根，毕华剑，刘新萍，吴元洁，周雪梅，刘德胜，董妍妍

(安徽中医药大学，安徽 合肥230012)

[摘要]目的探讨抵当汤及其拆方对糖尿病大鼠肥大心肌细胞JAK2/STAT3信号通路的影响。方法单次注射链脲佐菌素复制糖尿病大鼠模型，将糖尿病大鼠随机分为模型组、抵当汤组、桃仁大黄组、水蛭虻虫组和缬沙坦组，以正常雄性SD大鼠作为正常对照组。正常对照组和模型组给予蒸馏水灌胃，其余各组大鼠接受相应药物灌胃，连续8周。采用Western blot法检测心钠素(atrial natriuretic peptide，ANP)、心肌组织JAK2和STAT3蛋白表达，采用实时荧光定量PCR法检测JAK2、STAT3 mRNA表达。结果与正常对照组比较，模型组ANP、JAK2、STAT3蛋白以及JAK2、STAT3 mRNA表达水平均显著上调(P<0.05)。水蛭虻虫拆方和桃仁大黄拆方对糖尿病大鼠心肌组织ANP、JAK2和STAT3蛋白表达的主效应均具有统计学意义(P<0.05)，两者的交互作用均无统计学意义(P>0.05)。水蛭虻虫拆方和桃仁大黄拆方对糖尿病大鼠心肌组织JAK2、STAT3 mRNA表达的交互作用具有统计学意义(P<0.05)。缬沙坦组、抵当汤组及两个抵当汤拆方组ANP、JAK2蛋白及JAK2 mRNA表达水平比较，差异具有统计学意义(P<0.05)。结论抵当汤延缓糖尿病大鼠心肌细胞肥大的机制与抑制JAK2/STAT3信号通路有关，其拆方对JAK2、STAT3 mRNA表达的效应存在相互影响。

[关键词]糖尿病；心肌细胞肥大；抵当汤；JAK2/STAT3信号通路

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是独立于高血压及冠状动脉粥样硬化，而直接由糖尿病导致心肌损害的一种临床疾病，是糖尿病的重要并发症和主要死因[1]。心肌细胞肥大为其主要病理特征之一。Janus激酶-信号转导子与转录激活子(janus activated kinase-signal transducer and activator of transcription，JAK-STAT)这一信号通路和心肌细胞肥大的关系十分密切[2-3]。

抵当汤具有化瘀泻热通络的功效，符合DCM病变脉络瘀阻的病机，临床及基础研究中，有较多的用于糖尿病及其并发症的防治[4-6]。在前期研究[7]中已经发现，抵当汤能够显著抑制糖尿病引起的心肌病变。本研究通过复制糖尿病模型，应用具有化瘀泻热通络作用的中药抵当汤及其拆方逐瘀通络水蛭虻虫煎剂、化瘀泻热桃仁大黄煎剂对DCM进行早期干预，以血管紧张素(angiotensin，Ang)Ⅱ受体阻滞剂缬沙坦为阳性对照药，观察各组大鼠心肌组织心钠素(atrial natriuretic peptide，ANP)水平，以及JAK2、STAT3蛋白及其mRNA的表达水平，探讨抵当汤及其两组拆方对糖尿病大鼠肥大心肌细胞JAK2/STAT3信号通路的干预作用。

1材料

1.1实验动物雄性SD大鼠115只，清洁级，体质量200～240 g，购于安徽医科大学动物实验中心，生产许可证号为SCXK(皖)2011-002。

1.2药物抵当汤方由桃仁25 g，制大黄15 g，水蛭、虻虫各10 g组成，购自安徽中医药大学第一附属医院药房。首次以10倍量水浸泡2 h，煮沸1 h，次煎以8倍量水煮沸1 h，之后合并2次滤液，再以文火浓缩使之含生药3 g/mL；其后再分别称取桃仁25 g、制大黄15 g为桃仁大黄组，水蛭、虻虫各10 g为水蛭虻虫组，煎煮方法、生药含量均与抵当汤相同，即得桃仁大黄煎液和水蛭虻虫煎液。装瓶后保存于0～4 ℃冰箱。缬沙坦胶囊为北京诺华制药有限公司产品，批号为国药准字H20040217，每粒80 mg，使用前用蒸馏水配制成混悬液。

1.3试剂和仪器链尿佐菌素(每支100 mg，批号 20130320546)：购自美国Sigma公司；10%水合氯醛(批号 20120210)：购自上海苏懿化学试剂有限公司；Trizol试剂(批号 14105)：购自Invitrogen公司；逆转录试剂盒(批号 00145205)：购自美国Thermo公司；实时荧光定量PCR仪、PikoReal 96荧光定量PCR仪：美国Thermo公司。

2方法

2.1糖尿病模型复制SD雄性大鼠115只，适应性喂养7 d，其中105只用于糖尿病模型复制。在实验前统一检测所有大鼠血糖，确保每只大鼠血糖值均在3.0～5.0 mmol/L范围内。根据课题组之前的模型复制方法[8]，一次性腹腔注射链尿佐菌素55 mg/kg，复制糖尿病大鼠模型，继续喂养3周后可出现明显的糖尿病心肌病变。同时为防止大鼠因血糖值过低而死亡，所有大鼠均给予5%葡萄糖饮水。在模型复制48 h后，开始给予自来水饮用；72 h后，尾静脉取血，检测随机血糖，以随机血糖大于16.7 mmol/L作为糖尿病大鼠模型复制成功的标准。将模型复制成功的100只大鼠按体质量区组随机分为5组：模型组、抵当汤组、水蛭虻虫组、桃仁大黄组和缬沙坦组，每组20只。从剩下的15只血糖水平正常的大鼠中选取10只作为正常对照组。

2.2给药方法模型复制成功后第2天开始给予灌胃给药。将保存备用的水蛭虻虫煎剂、桃仁大黄煎剂、抵当汤煎剂分别用蒸馏水配成1.0 g/mL的3组溶液，各中药组大鼠均按每日10 mL/kg接受灌胃给药。缬沙坦组大鼠接受缬沙坦混悬液(每日80 mg/kg)灌胃给药；正常对照组和模型组大鼠分别接受等容量蒸馏水灌胃。连续8周。

2.3取材末次灌胃后，将所有大鼠禁食10 h，再称其体质量，用10%水合氯醛腹腔注射(3 mL/kg)麻醉，迅速剖开胸腔，取出心脏，剪取左心室心肌组织约0.5 cm×0.5 cm，冻存于-80 ℃冰箱待检。

2.4Western blot法检测心肌组织ANP、JAK2和STAT3蛋白表达取大鼠心肌组织，用Trizol试剂提取组织蛋白质，用Bradford方法测定蛋白质含量。将提取的等量蛋白质加入2倍加样缓冲液，煮沸10 min后冷却，上样到SDS-PAGE加样孔内，垂直电泳，然后将蛋白质转移到PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭PVDF膜2 h，滴加稀释的一抗，TBST洗脱后，滴加二抗，再TBST洗脱，用化学发光剂温浴1 min后曝光、显影和定影，最后扫描，对条带灰度进行分析，以目的蛋白与内参蛋白β-actin的灰度比值表示目的蛋白的相对表达水平。

2.5实时荧光定量PCR法检测JAK2、STAT3 mRNA表达取冻存的心肌组织，置于离心管中，用Trizol法抽提RNA。取RNA样品3 μg以oligo(dT)进行逆转录反应，合成cDNA。引物及内参照均由Invitrogen公司合成。目的基因JAK2上游引物：5′-TATACTATGGAAACTTGGAGTGGCC-3′，下游引物：5′-AATGTCCTTTGGTAGAACTGTGATG-3′；Stat3上游引物：5′-GAGGAGGCATTCGGAAAGTATT-3′，下游引物：5′-CAGGTCGTTGGTGTCACACA-3′；内参β-actin上游引物：5′-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3′，下游引物：5′-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3′。取出上述cDNA反应液1 μL作为荧光定量的模板，进行PCR扩增，总反应体系10 μL：内含2倍SYBR格林混合液5 μL，上游引物10 μmol/L 1 μL，下游引物10 μmol/L 1 μL，模板DNA 1 μL，无水RNA酶2 μL，置于实时荧光仪中进行扩增。反应条件为：95 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40个循环。PCR反应产物经过1%琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像仪观察拍照，计算目的基因与内参照基因条带的密度比值，作为目的基因的相对表达水平。

3结果

3.1模型因素对糖尿病大鼠心肌组织ANP、JAK2和STAT3蛋白表达的影响与正常对照组比较，模型组ANP、JAK2和STAT3蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。见表1和图1。

3.2抵当汤及其拆方对糖尿病大鼠心肌组织ANP、JAK2和STAT3蛋白表达水平的影响以模型组、水蛭虻虫组、桃仁大黄组和抵当汤组作为实验组合进行两因素析因设计的方差分析，结果显示水蛭虻虫拆方和桃仁大黄拆方对大鼠心肌组织ANP、JAK2和STAT2的主效应均具有统计学意义(P<0.05)，两个拆方的交互作用均无统计学意义(P>0.05)。见表2。结果提示，水蛭虻虫拆方和桃仁大黄拆方均可显著降低糖尿病大鼠心肌组织ANP、JAK2和STAT3表达水平，尚不能认为水蛭虻虫拆方和桃仁大黄拆方对这3种蛋白的表达具有协同或拮抗作用。

3.3抵当汤及其拆方和缬沙坦对糖尿病大鼠心肌组织ANP、JAK2和STAT3蛋白表达水平的影响以水蛭虻虫组、桃仁大黄组、抵当汤组和缬沙坦组为实验组合进行单因素方差分析，结果显示4组糖尿病大鼠心肌组织ANP和JAK2蛋白表达水平比较，差异具有统计学意义(ANP：F(3，8)=10.90，P=0.003；JAK2：F(3，8)=8.39，P=0.007)；4组STAT3表达水平比较，差异无统计学意义(F(3，8)=2.16，P=0.171)。多重比较发现，缬沙坦对ANP表达的效应与抵当汤相当(P>0.05)，而对JAK2表达的效应与水蛭虻虫拆方和桃仁大黄拆方相当(P>0.05)，对STAT3表达的效应与抵当汤全方及其拆方均相当(P>0.05)。见表1。

表1　各组糖尿病大鼠ANP、JAK2和STAT3蛋白相对表达水平比较

注：与正常对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与水蛭虻虫组比较，◇P<0.05；与桃仁大黄组比较，☆P<0.05；与抵当汤组比较，□P<0.05。

表2　抵当汤及其拆方对糖尿病大鼠心肌组织ANP、JAK2和STAT3相对表达水平影响的两因素析因设计方差分析

注：A.正常对照组；B.模型组；C.抵当汤组；D.水蛭虻虫组；E.桃仁大黄组；F.缬沙坦组。

图1抵当汤及其拆方对ANP、JAK2和STAT3蛋白相对表达的影响(Western blot法)

3.4模型因素对糖尿病大鼠心肌组织JAK2 mRNA、STAT3 mRNA表达水平的影响与正常对照组相比，模型组JAK2 mRNA和STAT3 mRNA表达水平明显上调(P<0.05)。见表3。

3.5抵当汤及其拆方对糖尿病大鼠心肌组织JAK2 mRNA、STAT3 mRNA表达水平的影响以模型组、水蛭虻虫组、桃仁大黄组和抵当汤组作为实验组合进行两因素析因设计的方差分析，结果显示水蛭虻虫拆方对大鼠心肌组织JAK2 mRNA表达水平的主效应具有统计学意义(P<0.05)，对STAT3 mRNA表达水平的主效应无统计学意义(P>0.05)，桃仁大黄拆方对JAK2 mRNA和STAT3 mRNA表达水平的主效应均具有统计学意义(P<0.05)，两个拆方的交互作用均具有统计学意义(P<0.05)。见表4。简单效应分析结果显示，抵当汤组JAK2 mRNA和STAT3 mRNA表达水平显著高于桃仁大黄组(P<0.05)，而与水蛭虻虫组JAK2 mRNA和STAT3 mRNA表达水平的差异无统计学意义(P>0.05)。

3.6抵当汤及其拆方和缬沙坦对糖尿病大鼠心肌组织JAK2 mRNA和STAT3 mRNA相对表达水平的影响以水蛭虻虫组、桃仁大黄组、抵当汤组和缬沙坦组为实验组合进行单因素方差分析，结果显示4组糖尿病大鼠心肌组织JAK2 mRNA表达水平比较，差异具有统计学意义(F(3，8)=48.31，P=0.000)；4组STAT3 mRNA表达水平比较，差异无统计学意义(F(3，8)=3.91，P=0.055)。多重比较发现，缬沙坦组JAK2 mRNA表达水平显著低于抵当汤及其拆方组(P<0.05)。见表3。

4讨论

本研究观察了具有化瘀泻热通络作用的《伤寒论》经方抵当汤及其2组拆方——具有化瘀泻热作用的桃仁大黄配伍和具有逐瘀通络作用的虻虫水蛭配伍对糖尿病大鼠肥大心肌细胞JAK2/STAT3信号通路的干预作用。

表3　各组大鼠JAK2 mRNA和STAT3

注：与正常对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与水蛭虻虫组比较，◇P<0.05；与桃仁大黄组比较，☆P<0.05；与抵当汤组比较，□P<0.05。

ANP是一种由心脏合成、贮存和分泌的活性多肽类激素，其代偿性升高，被公认为心肌细胞肥大的特征性指标之一[9]，可作为早期诊断DCM的一项参考指标[10]。Oh YB等[11]研究发现，Ang Ⅱ通过血管紧张素1型受体(receptor, angiotensin, type 1, AT1)抑制内源性ANP的分泌。Luchner等[12]研究发现，心肌细胞肥大发生发展过程中，伴随ANP不断升高，然而当心肌细胞肥大受到抑制后，ANP水平亦会相应降低。缬沙坦作为Ang Ⅱ受体拮抗剂，通过阻断Ang Ⅱ与其受体AT1结合来延缓心肌细胞肥大[13]。本研究中模型组和正常对照组相比，大鼠心肌细胞ANP表达显著上调，说明糖尿病时出现心肌细胞肥大的表现，而治疗组ANP下调，说明抵当汤可以预防心肌细胞肥大的发生，与缬沙坦的作用相当，但全方的作用优于逐瘀通络水蛭虻虫配伍和化瘀泻热桃仁大黄配伍。

JAK/STAT信号通路包括JAKs家族和STATs家族，JAKs是一种酪氨酸蛋白激酶，STATs家族是其下游信号分子。当细胞外信号分子与膜受体结合后，激活胞内偶联的JAKs激酶，激活后的JAKs又能够磷酸化受体上的酪氨酸位点，使受体产生与STATs结合的区域，从而使STATs磷酸化，形成二聚体，从而将信号由细胞膜向核内传递[14]。研究[15]发现,JAK2、STAT3表达异常在心肌细胞肥大的发病机制中扮演重要角色，具有活血祛瘀的中药能通过抑制JAK2、STAT3的表达防治心肌细胞肥大。本研究显示，抵当汤组和缬沙坦组下调JAK2和STAT3 mRNA及其蛋白的表达，抑制JAK/STAT信号通路，对糖尿病心肌细胞肥大有干预作用；拆方组作用同样弱于全方组和缬沙坦组。

综上，具有化瘀泻热通络作用的抵当汤抑制心肌细胞肥大与调控JAK/STAT信号通路，下调ANP的表达密切相关，且化瘀泻热通络的抵当汤作用优于仅具有逐瘀通络的水蛭虻虫配伍和化瘀泻热的桃仁大黄配伍。说明经方的配伍组成有其合理性，对糖尿病心肌细胞肥大的抑制作用来看，化瘀泻热通络作用综合起来较之单一作用为优。

参考文献：

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Effect of Didang Decoction on Myocardial JAK2/STAT3 Pathway in Diabetic Rats

ZHANGKai,CHUQuan-gen,BIHua-jian,LIUXin-ping,WUYuan-jie,ZHOUXue-mei,LIUDe-sheng,DONGYan-yan

(AnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230012,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the effect of Didang Decoction and its separated recipes on the JAK2/STAT3 pathway in hypertrophic cardiomyocytes in diabetic rats. MethodsA rat model of diabetes was established with a single injection of streptozotocin (STZ). The diabetic rats were randomly divided into model group, Didang Decoction group, Taoren Dahuang group, leech-gadfly group, and valsartan group, and normal male Sprague-Dawley rats were used as normal control group. The rats in the normal control group and model group were given distilled water by gavage, and those in the other groups were given corresponding drugs by gavage for 8 weeks continuously. Western blot was used to measure atrial natriuretic peptide (ANP) level and the protein expression of JAK2 and STAT3 in the myocardium, and quantitative real-time PCR was used to measure the mRNA expression of JAK2 and STAT3.ResultsCompared with the normal control group, the model group showed significantly upregulated ANP level and protein and mRNA expression of JAK2 and STAT3 (P<0.05). The leech-gadfly recipe and Taoren Dahuang recipe showed significant main effects on ANP level and the protein expression of JAK2 and STAT3 in the myocardium of diabetic rats (P<0.05), but the interaction between the two recipes was not significant (P>0.05). The leech-gadfly recipe and Taoren Dahuang recipe showed a significant interaction in regulating the mRNA expression of JAK2 and STAT3 in the myocardium of diabetic rats (P<0.05). The ANP level and the mRNA and protein expression of JAK2 showed significant differences between the valsartan group, Didang Decoction group, Taoren Dahuang group, and leech-gadfly group (P<0.05).ConclusionThe mechanism of action of Didang Decoction in delaying cardiomyocyte hypertrophy in diabetic rats may be related to its inhibitory effect on the JAK2/STAT3 pathway, and the separated recipes of Didang Decoction interact with each other in regulating the mRNA expression of JAK2 and STAT3.

[Key words]Diabetes; Cardiomyocyte hypertrophy; Didang Decoction; JAK/STAT pathway

(收稿日期：2015-09-11；编辑：曹健)

[中图分类号]R587.1；R285.5[DOI]10.3969/j.issn.2095-7246.2016.02.022

通信作者：储全根，chuquangen@sohu.com

作者简介：张凯(1979-)，硕士，讲师

基金项目：国家自然科学基金项目(81273645)；安徽省自然科学基金项目(1408085MKL32)