蒙药嘎日迪-13对脑缺血损伤大鼠不同时相血清及脑组织不同脑区P-selectin含量及表达的影响

何静波 张浩楠 田彩云 郑延泽 武海军 杨玉梅

(包头医学院，内蒙 包头 024000))

蒙药嘎日迪-13对脑缺血损伤大鼠不同时相血清及脑组织不同脑区P-selectin含量及表达的影响

何静波 张浩楠 田彩云 郑延泽 武海军 杨玉梅*

(包头医学院，内蒙 包头 024000))

目的：研究蒙药嘎日迪-13对脑缺血损伤大鼠不同时相血清中P-selectin含量及脑中P-selectin表达量的影响。方法:360只雄性SD大鼠随机分为脑缺血模型组、假手术组、嘎日迪-13大、中、小剂量组，每组又随机分为6个时相组即1 h、6 h、12 h、24 h、72 h与120 h组，灌胃给药，1次/d，连续27天后，线栓法制备大鼠大脑中动脉栓塞模型，进行神经功能评分后取材测定血清中P-selectin含量，免疫组化法测定脑组织中P-selectin的表达。结果:与假手术组比较，模型组大鼠神经功能评分、血清中P-selectin含量、脑组织中P-selectin表达量明显升高(P<0.01)；与模型组比较，噶日迪-13给药组可明显降低脑缺血大鼠神经功能评分、血清中P-selectin含量、脑组织中P-selectin表达量(P<0.01或P<0.05)。结论:蒙药嘎日迪-13可明显降低血清中P-selectin含量、脑组织中P-selectin表达量，提示蒙药嘎日迪-13抑制炎症因子P-selectin表达可能是其对脑缺血保护作用的机制之一。

蒙药；嘎日迪-13；脑缺血；大鼠； P-selectin

蒙药嘎日迪-13由甘草、石菖蒲、沉香、肉豆蔻、磁石(煅)、木香、麝香、草乌(制)、诃子、珊瑚(制)、丁香和禹良土13味药组成，是蒙医常用的治疗心脑血管疾病和神经系统疾病的传统方剂之一，主治半身不遂、左瘫右痪、口眼歪斜、言语不清、筋骨疼痛、神经麻痹、风湿、关节疼痛、四肢麻木、腰腿不利等症状。药理实验和临床研究表明[1-6]，蒙药嘎日迪-13对缺血性脑损伤具有明显的保护作用。

脑缺血再灌注损伤与黏附分子介导的白细胞、内皮细胞黏附关系密切，选择素是近年来新定义的一类细胞黏附分子。实验研究表明，当脑缺血再灌注时P-selectin表达上调，白细胞在P-selectin的介导下从血中迁移至脑组织，释放有害物质，进而造成脑组织损伤[7]。

本研究通过测定脑缺血后大鼠不同时相血清中P-selectin的含量、不同脑区P-selectin表达量的影响，探讨脑缺血后嘎日迪-13的保护作用机制。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂：嘎日迪-13，内蒙古奥特奇蒙药股份有限公司(金山)蒙药厂，批号：080905；戊巴比妥钠，佛山市化工实验厂进口分装，批号：860901；青霉素(400万u/瓶)，华北制药公司；P-selectinELISA试剂盒，上海彩佑试剂公司；P-selectin免疫组化试剂盒，北京博奥森；PV-6000通用型二抗试剂盒，6mL；ZLI-9018 DAB kit 3mL；PBS缓冲液(0.01M;pH=7.2～7.4)；柠檬酸盐修复液(pH=6.0；0.01M)。其他试剂均为分析纯。

1.2 主要仪器：RT-6000全自动酶标仪，美国雷杜公司；RT-2600C自动洗板机，美国雷杜公司；MTS 2/4酶标板振荡器，德国IKA公司；Leica 2135石蜡病理切片机，德国Leica公司；YB-7B病理组织包埋机，安徽电子科学研究所；ZT-12P生物组织自动脱水机，湖北亚光医用电子技术有限公司；QP切片漂烘仪，安徽电子科学研究所；Leica激光共聚焦显微镜，德国Leica公司； TG16-WS台式高速离心机，湖南湘仪离心机有限公司。

1.3 实验动物：SD大鼠，雄性，清洁级，360只，体重200±50g，由北京大学医学部实验动物科学部提供，许可证编号：SCXK(京)2011-0012。环境温度为22～26℃，按每笼6只饲养，试验期间各鼠均自由进行饮水摄食。

2 方法

2.1 动物分组及模型制备：360只雄性SD大鼠随机分为：脑缺血模型组(vehicle control，n=72)，假手术组(n=72)，嘎日迪-13大剂量组(Garidi13 large dose group，Garidi L,n=72)1.2g/100mL，嘎日迪-13中剂量组(Gridi13 middle dose group，Garidi M,n=72)0.6g/100mL，嘎日迪-13小剂量组(Garidi13 small dose group，Garidi S,n=72)0.3g/100mL，每个剂量组下分6个时相即1h、6h、12h、24h、72h与120h。各组大鼠均进行灌胃给药(2mL/100g，模型组与假手术组给予等体积生理盐水)，连续27d，1次/d，末次给药后1h开始造模。模型制备采用改良Zea Longa[8]等的线栓法加以改良制作大脑中动脉缺血模型。

2.2 神经功能评分:采用Zea Longa[8]五级评分标准对大鼠进行神经功能评分。

2.3 取材:于规定时间点眼眶取血，室温放置2h，离心(3000r/min)取血清冻存备用；以3%戊巴比妥钠(0.1mL/100g)麻醉大鼠，开胸暴露心脏，用室温生理盐水通过左心尖部，沿升主动脉灌注冲血，同时剪开右心耳，可见右心耳流出液体的颜色逐渐由鲜红色变为淡红色,至基本无色为止，换4%甲醛灌流，至大鼠肢体、尾巴僵直，即表明固定成功。开颅取脑，缺血侧脑组织样本放置于4%甲醛内固定24h。

2.4 指标检测

2.4.1 血清中P-selectin含量测定：严格按照试ELISA剂盒说明书操作。

2.4.2 免疫组化检测大鼠缺血脑组织不同区域P-selectin表达：将固定好的脑组织样本冲洗脱水后用石蜡包埋，切成3～4μm薄片，65℃烤片1h待用，其余步骤严格按照试剂盒说明书严格操作，显微镜下观察。 P-selectin阳性反应为细胞浆棕黄色深染，高倍镜下(×400)随机观察缺血区域不重叠的5个视野，计数P-selectin胞浆阳性细胞数，取平均值。

3 结果

3.1 神经功能评分结果:与假手术组比较，各时相脑缺血模型组神经功能评分明显升高(*P< 0. 01)，说明大鼠局灶性脑缺血模型制作成功；各时相嘎日迪-13大、中、小剂量组与模型组比较，神经功能评分明显降低(**P< 0. 01)；各剂量组之间比较，神经功能评分不存在显著差别(***P>0. 05)。见表1。

表1 嘎日迪-13在不同时相对局灶性脑缺血大鼠神经功能评分的影响

注：图示为均数±标准差。与假手术组比较*P<0.01；与模型组比较**P<0.01。

3.2 嘎日迪-13对脑缺血大鼠血清中不同时相P-selectin含量变化的影响:与假手术组比较，各时相脑缺血模型组大鼠血清中P-selectin含量明显升高(P< 0. 01)；与脑缺血模型组比较，各时相扎冲-13味大、中、小剂量剂量组大鼠血清中P-selectin含量明显降低(P<0. 05)；剂量组各时相之间比较，大鼠血清中P-selectin含量不存在明显差别(P>0. 05)。见表2。

表2 扎冲-13味在不同时相对局灶性脑缺血大鼠血清中P-selectin含量的影响

注：为均数±标准差。与假手术组比较※※P<0.01；与模型组比较##P<0.01。

3.3 嘎日迪-13对脑缺血大鼠不同脑区P-selectin表达的影响

3.3.1 嘎日迪-13对脑缺血大鼠大脑海马中P-selectin表达的影响:与假手术组比较，各时相脑缺血模型组大鼠海马中P-selectin表达量明显升高(P< 0. 01)；与脑缺血模型组比较，12h、24h、72h、120h时相嘎日迪-13大、中、小剂量剂量组大鼠海马中P-selectin表达量明显降低(P<0. 01)，1h和6h时相组大、中剂量剂量组大鼠海马中P-selectin表达量明显降低(P<0. 01)；剂量组各时相之间比较，中剂量组1h时相组大鼠海马中P-selectin表达量不存在明显差别(P>0. 05)。见表3。

表3 嘎日迪-13在不同时相对局灶性脑缺血大鼠海马中P-selectin表达量的影响

注：图示为均数±标准差。与假手术组比较1)P<0.01；与模型组比较2)P<0.01。

3.3.2 嘎日迪-13对脑缺血大鼠大脑纹状体中P-selectin表达的影响：与假手术组比较，各时相脑缺血模型组大鼠纹状体中P-selectin表达量明显升高(P< 0. 01)；与脑缺血模型组比较，各时相嘎日迪-13大、中、小剂量剂量组大鼠纹状体中P-selectin表达量明显降低(P<0. 01)；1h、6h时相各剂量组各时相之间比较，大鼠纹状体中P-selectin表达量无明显差异(P>0. 05)；嘎日迪-13大剂量剂量组与中、小剂量组比较，大鼠纹状体中P-selectin表达量明显降低(P<0. 01)。见表4。

表4 嘎日迪-13在不同时相对局灶性脑缺血大鼠纹状体中P-selectin表达量的影响

注：图示为均数±标准差。与假手术组比较※※P<0.01；与模型组比较##P<0.01。

3.3.3 嘎日迪-13对脑缺血大鼠大脑皮质中P-selectin表达的影响： 与假手术组比较，各时相脑缺血模型组大鼠大脑皮质中P-selectin表达量明显升高(P< 0. 01)；与脑缺血模型组比较，12h、24h、72h、120h时相嘎日迪-13大、中、小剂量剂量组大鼠大脑皮质中P-selectin表达量明显降低(P<0. 01)，1h和6h时相组嘎日迪-13大、中剂量剂量组大鼠大脑皮质中P-selectin表达量明显降低(P<0. 01)；剂量组各时相之间比较，中剂量组1h时相组大鼠大脑皮质中P-selectin表达量不存在明显差别(P>0. 05)。见表5。

表5 嘎日迪-13在不同时相对局灶性脑缺血大鼠大脑皮质中P-selectin表达量的影响

注：图示为均数±标准差。与假手术组比较※※P<0.01；与模型组比较##P<0.01#P<0.05。

4 讨论

脑缺血损伤后，炎性细胞因子的表达和炎性细胞浸润可诱发一系列炎症反应而加重脑组织损伤。炎症因子可以作用于血管内皮，引起脑水肿，并破坏血脑屏障的正常生理结构和功能，而炎症反应可引起局部脑血管痉挛或栓塞，进一步加重脑组织缺血缺氧。经过大量实验研究表明提示炎症反应对缺血脑组织是一把双刃剑，早期的炎症反应会加重神经细胞的损害作用[9]，而晚期炎症反应有益于神经细胞的再生和恢复[10]。在针对脑缺血再灌注损伤的研究中已经证实，脑缺血后脑组织出现病理改变，缺血程度较轻的部位大多出现细胞凋亡，而缺血程度较重的部位则出现细胞坏死；目前针对脑组织病理形态学学研究较多的是脑组织的海马、纹状体、大脑皮层等区域。

P-selectin是存在于血小板和内皮细胞细胞膜上的跨膜糖蛋白，通常储存于内皮细胞的分泌颗粒中， 表达于活化的内皮细胞和，活化的血小板经刺激后数分钟内即迁移到内皮细胞表面,主要参与介导白细胞和内皮细胞的起始粘附，在白细胞黏附的前期起着重要作用。研究表明[11],血小板上的P-selectin在脑缺血时能通过增加血管内皮细胞与血小板相互作用或血小板聚集,使中性粒细胞移行和黏附,促进微血栓在损伤组织的毛细血管内形成。在缺血性脑损伤中，P -selectin介导了起始黏附作用，作用时间短暂且是可逆的，E-selectin则介导了持续性的粘附作用。

本实验中，脑缺血后模型组大鼠神经功能评分和血清P-selectin含量及脑内P-selectin表达明显升高，表明脑缺血模型建立成功，嘎日迪-13各给药组血清P-selectin及其在不同脑区的表达显著降低，表明嘎日迪-13保护脑缺血作用机制可能为抑制炎症因子，而抑制P-selectin表达是其有效机制之一。

[1]李月玲,杨玉梅,张东.扎冲十三味片对大鼠局灶性脑缺血的作用[J].中国民族医药杂志,2009,8:55-56.

[2]武海军,杨玉梅,何静波.扎冲十三味及其有效组分挥发油对大鼠脑缺血的保护作用[J].中药药理与临床,2012,28(5):190-192.

[3]乔海霞,杨玉梅,武海军,等.扎冲十三味片对局灶性脑缺血大鼠血脑屏障的保护作用[J].包头医学院学报,2012,28,(5):1-3.

[4]包巴根那,陈娟.蒙药扎冲十三味丸治疗急性脑梗死68例疗效观察[J].中国中西医结合急救杂志,2006,13(5):315-316.

[5]特木其乐,额尔敦其木格,恩和巴图,等.扎冲十三味丸治疗出血性脑卒中340例临床报道[J].中国民族医药杂志,2005,11(6):2.

[6]王玉山,特木其乐,娜仁图雅,等.扎冲十三味丸治疗脑梗死400例临床疗效观察[J].中国民族医药杂志,2005,11(6):3.

[7]Zhang R, Chopp M, Zhang Z, et a1.The expression?of P-selectins and E-selectins in three models of middle cerebralartery occlusion[J].Brain Resselectins1998selectins785(2):207-214.

[8]Zea Longa EL, Weinstein RP, Carlon S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion with out craniectomy in rats[J].Stroke, 1989, 20(1):84-91.

[9]Williams AJ,Dave JR,Tortella FC．Neuroprotection with the proteasome inhibitor MLN519 in focal ischemic brain injury: relation to nuclear factor kappaB (NF-kappaB), inflammatory gene expression, and leukocyte infiltration[J]．Neurochem Int,2006,49(2):106-112.

[10]Hirschberg DL, Yoles E, Belkin M,et al.Inflammaion after axonal injury has conflicting consequences for recovery of function: rescue of spared axons is impaired but regeneration is supported [J].J Neuroimmunol,1994,50(1):9-16.

[11]Kogaki S, Sawa Y, Sano T, et al. Selectin on activated platelets enhances neutrophil endothelial adherence in myocardial reperfusion injury[J]. Cardiovasc Res,1999, 43(4):968-973.

2016年9月22日收稿

国家自然科学基金项目，编号81160560

何静波，女，硕士研究生;研究方向：心脑血管与中蒙药药理研究;E-mail:63403584@qq.com，Tel:13948420925

*通讯作者：杨玉梅, 女，教授，Tel:13847230457,E-mail:yym457@aliyun.com

R291.2

A

1006-6810(2016)12-0034-04