聚酰胺-大孔树脂联用富集桑叶总黄酮工艺研究

杨超，刘冬恋，谭林，杨春梅，牟倩云（成都医学院药学院，四川成都610083）



聚酰胺-大孔树脂联用富集桑叶总黄酮工艺研究

杨超，刘冬恋*，谭林，杨春梅，牟倩云
（成都医学院药学院，四川成都610083）

摘要：样品溶液先以聚酰胺吸附，水洗除杂，再将除杂后的聚酰胺加于大孔吸附树脂顶部，以乙醇洗脱，富集桑叶总黄酮。试验结果显示聚酰胺与D-101大孔树脂联用能有效富集桑叶中的总黄酮。最佳工艺条件为聚酰胺料液比2.50 g/mL，大孔树脂料液比5.50g/mL，以80%乙醇洗脱，收集洗脱液6 BV，富集总黄酮纯度为48.09%。该方法优于目前常用的桑叶总黄酮富集方法，工艺稳定简单，具有较好的可行性。

关键词：总黄酮；桑叶；富集方法；聚酰胺-大孔树脂联用

桑叶为桑科植物桑Morua alba L.的干燥叶，桑叶苦、甘、寒，归肺、肝经，具有疏散风热、清肺润燥、平肝明目、凉血止血之功效[1]。现代药理及临床研究表明，桑叶提取物在治疗糖尿病、高血压、高血脂及抗衰老等方面都具有良好的疗效。桑叶总黄酮具有降血糖、血脂[2]，清除氧自由基[3]、抗运动疲劳[4]等作用。目前，桑叶总黄酮的富集主要采用大孔树脂为主体的纯化方法，但富集物的纯度普遍较低。本试验用聚酰胺-大孔树脂联用技术富集桑叶总黄酮，采用Box-Behnken设计方法，探索使富集物纯度大幅度提高的纯化方法，为桑叶总黄酮的精制提供理论基础。

1　材料、试剂与仪器

桑叶（批号：130624）：四川省中药饮片有限责任公司，经成都医学院生药教研室游元元副教授鉴定为桑科植物桑Morus alba L.的干燥叶；芦丁对照品（批号：13040302）：中国药品生物制品鉴定所；X-5、DA-201、AB-8、DM-301、D-101大孔吸附树脂：天津海光化工有限公司；柱层析用聚酰胺（60目～80目，批号：20130615）：江苏长丰化工有限公司；其它所用试剂均为分析纯。

BSA223S型万分之一电子天平：赛多利科学仪器有限公司；HH-S4型电热恒温水浴锅：北京伟永仪器有限公司；Alpha-1900紫外可见分光光度计：上海谱元仪器有限公司；R215旋转蒸发仪：瑞士步琪公司；SHZ-82型超声震荡仪：江苏亿通电子有限公司。

2　方法与结果

2.1对照品溶液的制备

精密称取芦丁标准品20.2 mg置于100 mL容量瓶中，以70 %乙醇定容制成浓度为0.202 mg/mL的对照品溶液。

2.2标准曲线的绘制

精密吸取芦丁对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL置于25 mL容量瓶中，加水至6 mL，加5 %亚硝酸钠溶液1 mL，摇匀放置6min，加10 %硝酸铝溶液1 mL，摇匀放置6 min，加氢氧化钠试液10 mL，再加水至刻度摇匀，放置15 min，在510 nm波长处测定吸收度。以浓度（C）与吸收度（A）进行线性回归，得回归方程A=7.237 5C+0.089 0，R2=0.999 7，表明二者在5.1 μg/mL～36.4 μg/mL的范围内具有良好的线性关系。

2.3供试品溶液的制备及测定方法

取适量桑叶打粉过40目筛，用25倍量体积分数为70 %的乙醇浸泡1 h，超声30 min，冷凝回流1.5 h，滤过，减压回收至溶剂无醇味，浸膏用70 %乙醇溶解，并稀释至质量浓度为0.263 g/mL，作为上柱供试液，并按照文献方法[5]测定，得到药材中总黄酮的量为3.75 %。

2.4聚酰胺洗脱分析

精密量取上柱供试液适量（约相当于2.00 g浸膏），拌入2 g干燥聚酰胺粉末，挥去溶剂后装入1.5 cm× 20 cm的层析柱，依次用水及20 %、40 %、60 %、80 %、95 %乙醇洗脱，分别收集洗脱液5 BV，将洗脱液干燥后称重，得到洗脱液中含有的固体量。同时，通过测定洗脱液中总黄酮的量，计算总黄酮的纯度和收率。

总黄酮纯度/% =（洗脱液中所含总黄酮量/洗脱液含固体量）×100；

总黄酮收率/% =（洗脱液中所含总黄酮量/上柱前药液所含总黄酮量）×100。

结果见图1。

图1　不同浓度的乙醇溶液对聚酰胺树脂洗脱的影响Fig.1 Effect of different concentration ethanol on elution of polyamide resin

由图1可知，在水洗脱液和95 %乙醇洗脱液中，总黄酮收率相对较少，杂质较多，而60 %～80 %乙醇洗脱液中的总黄酮纯度和收率均较高，具有很好的总黄酮富集作用。药液经过聚酰胺的吸附后，用水将生物碱类成分和水溶性杂质脱除，再用60 %～80 %的乙醇作为洗脱液，可实现桑叶总黄酮的初步富集。

2.5大孔树脂型号的筛选

取等量型号不同的大孔树脂，见表1。

表1　5种树脂的物理特性Table 1 Physical characteristics of five resin

预处理后装入层析柱。供试品溶液5等份分别加入等量的聚酰胺粉末，挥干溶剂后置于1.5 cm×20 cm的层析柱中，以等量水洗脱至流出液近无色（7 BV）。将水洗脱后的聚酰胺分别置于预先以水为填充溶剂的大孔树脂层析柱（2.5 cm×30 cm）上部，用80 %乙醇洗脱，收集洗脱液5 BV。测定洗脱液中的固体量及总黄酮的量，计算总黄酮纯度和收率。结果见图2。

图2　不同型号大孔树脂对桑叶总黄酮洗脱效果的考察Fig.2 Elution for total flavonoids of mulberry leaves on different types of macroporous resins

由图2可知，5种树脂中非极性的D-101在桑叶总黄酮的纯度和收率方面效果最好，因此，选用D-101为优选大孔树脂。

2.6洗脱溶剂浓度的考察

精密量取供试品溶液适量（约相当于2.00 g浸膏）与2.00 g聚酰胺混合，置于预先以水为溶剂填充的D-101大孔树脂层析柱上部，先以水洗至流出液近无色（5 BV），后依次用体积分数为15 %、30 %、50 %、60 %、70 %、80 %、95 %乙醇洗脱，分别收集洗脱液6 BV，测定洗脱液中所含的固体重量和总黄酮的量，计算总黄酮纯度和收率。结果见图3。

由表3可知，供试液经聚酰胺初步精制后再通过大孔树脂柱，60 %～80 %乙醇洗脱部分总黄酮收率为69.17 %，其中80 %乙醇洗脱部分总黄酮的纯度和收率分别为45.53 %、48.31 %，因此选用80 %乙醇作为洗脱溶剂。

图3　不同浓度乙醇对洗脱效果的影响Fig.3 Effects of different ethanol concentrations on elution efficiencies

2.7响应面试验设计及结果

2.7.1响应面试验设计

根据Box-Behnken试验设计原理，在单因素试验设计的基础上，设计17个试验点，12个分析点，5个零点以估计误差，选用聚酰胺（g）与上样体积（mL）之比即聚酰胺料液比X1、洗脱液收集量X2、大孔树脂（g）与上样体积（mL）之比即大孔树脂料液比X3为变量，以桑叶总黄酮纯度为响应值R进行响应面分析。试验设计水平表见表2。

表2　响应面试验水平表Table 2 Factors and levels of RSM

2.7.2数据处理

利用Design-Expert 8.0.5软件，采用二项式模型进行回归分析。

2.7.3 Box-Behnken试验设计及结果

Box-Behnken试验设计及结果见表3、4。

表3　响应面分析结果Table 3 The results of response surface analysis

续表3　响应面分析结果Continue table 3 The results of response surface analysis

注：*表示P<0.05；**表示P<0.01。

通过对试验结果进行响应面分析，得到二次回归拟合方程式：总黄酮纯度/% = 47.04+1.17X1-1.57X2-3.05X3+4.14X1X2-3.80X1X3-0.14X2X3-2.24X12-6.40X22-4.83X32

由表4可知，模型的P<0.01，说明试验所选用的二次多项模型具有极显著性；失拟项P>0.05，表明失拟项不显著；且校正系数R2=0.972 9，表明模型充分拟合试验数据，因此可用此模型来分析和预测纯化桑叶总黄酮的工艺[6]。由F值可知，各因素对总黄酮纯度的影响次序：洗脱液收集量>大孔树脂料液比>聚酰胺料液比。

2.7.4响应面图分析

利用RSM研究聚酰胺料液比、洗脱液收集量与大孔树脂料液比的交互作用对桑叶总黄酮纯度的影响，得出响应面分析图及相应等值线图。结果见图4。

图4（A）中，由交互作用的等高线可知，沿洗脱液收集量轴向等高线密集，而大孔树脂料液轴向等高线相对稀疏，说明洗脱液收集量对响应值峰值的影响比大孔树脂料液比大。图4（B）中，聚酰胺料液比对响应值影响不显著，表现为曲面平缓，等高线稀疏，大孔树脂料液比轴向等高线相对密集，说明大孔树脂料液比对响应值峰值的影响比聚酰胺料液比大。图4（C）中响应值随洗脱液收集量呈现由低到高再降低的趋势，即响应值在零水平附近具有极大值。洗脱液收集量轴向等高线相对密集，说明洗脱液收集量对响应值峰值的影响比聚酰胺料液比大。

图4　两因素交互作用对总黄酮纯度的响应面图和等高线图Fig.4 Response surface and contour plots for the effect of operating parameters on the purity of total flavonoids

因此推断对响应值的影响顺序为：洗脱液收集量＞大孔树脂料液比＞聚酰胺料液比，这和方差分析结果一致。可通过软件对模型极值求解和分析等高线得到最佳洗脱条件：聚酰胺料液比2.48 g/mL，洗脱液收集量6.12 BV，大孔树脂料液比5.36 g/mL。

2.8验证试验

为检验试验结果的可靠性，采用最优提取条件进行桑叶总黄酮的分离纯化试验，同时考虑到实际操作的便利，将洗脱的最佳条件修正为聚酰胺料液比2.50 g/mL，洗脱液收集量6 BV，大孔树脂料液比5.50 g/mL，实际得到总黄酮纯度为48.09 %，总黄酮的纯度由原来的3.75 %提高到48.09 %，提高了12.84倍，表明此工艺提取效果较为理想性。

3　讨论

聚酰胺、大孔吸附树脂是分离总黄酮类物质的常用材料，其吸附机理不同，聚酰胺分子中含有丰富的酰胺基，可与黄酮类和多酚类化合物的酚羟基形成氢键结合从而被吸附，化合物分子中酚羟基数目越多，吸附力越强[7]。大孔树脂具有良好的网状结构和很高的比表面积，可以通过物理吸附方式从水溶液中有选择地吸附有机物，从而达到分离提纯的目的[8]。D-101大孔树脂是一种非极性的吸附树脂，通过与小分子内的疏水部分的作用吸附溶液中有机物[9]。将聚酰胺与大孔吸附树脂联用可充分发挥两者优势，弥补不足。选择以聚酰胺作吸附剂，是因为聚酰胺可较好的截留中药中的色素和部分脂溶性成分从而减轻了大孔树脂的负担和压力，且经过水洗可除去大部分水溶性杂质，有效的保留了主要药效成分总黄酮[10]。利用大孔树脂吸附和分子筛的双重作用，经聚酰胺初步精制的上柱液进入大孔树脂柱后将得到进一步分离纯化。

本试验对几种常用的大孔树脂进行了筛选，选出非极性的D-101为富集桑叶总黄酮的优选树脂，同时进行了聚酰胺料液比、大孔树脂料液比、洗脱剂浓度和洗脱液收集量的考察，得到桑叶总黄酮较高的纯度。但由于时间的关系，未对树脂径高比、聚酰胺的拌合方式、水洗脱用量和低浓度乙醇除杂效果等因素进行考察，这些工作有待于进一步研究。

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Enrichment of Total Flavonoids of Mulberry Leaves with Polyamide-macroporous Resin

YANG Chao，LIU Dong-lian*，TAN Lin，YANG Chun-mei，MOU Qian-yun
（Department of Pharmacy，Chengdu Medical College，Chengdu 610083，Sichuan，China）

Abstract：Polyamide adsorbed with sample was washed with water first to eliminate the impurities and then was loaded on the top of macroporous resin．The total flavonoids of mulberry leaves were enriched by eluting with ethanol．The results showed that D -101 resin combined with polyamide could effectively enrich the total flavonoids of mulberry leaves. The preferred condition for the procedure was as following：the weight of polyamide and D-101 resin was 2.50 and 5.50 times of the volume of sample，respectively．The volume of 80 % ethanol for elution was 6 times of the column volume．The purity of total flavonoids reached to 48.09 %．The process is simple and convenient，and the regeneration of resin is easy，which has a good application foreground．

Key words：total flavonoids；mulberry leaves；enriching method；polyamide-macroporous resin

收稿日期：2015-09-14

*通信作者：刘冬恋，女，硕士，实验师。

作者简介：杨超（1992—），男（汉），学士，研究方向：药学。

基金项目：四川省省级大学生创新创业训练计划项目（201313705013）；成都医学院校级大学生创新实验项目（CXJS201419）；成都医学院实验室开放项目（Kf201406）

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.08.011