丹磺酰氯对异丙酚荧光衍生化的工艺研究

李莹，李莉(新疆医科大学药学院，乌鲁木齐　830011)



丹磺酰氯对异丙酚荧光衍生化的工艺研究

李莹，李莉
(新疆医科大学药学院，乌鲁木齐830011)

摘要:目的以丹磺酰氯(DNS-Cl)作为荧光衍生化试剂对异丙酚进行荧光衍生化方法的研究与探讨。方法DNS-Cl对异丙酚荧光衍生化后，衍生产物用荧光分光光度法检测，通过单因素变量法考察衍生化条件。结果当DNS-Cl与异丙酚的摩尔比为8∶1，在浓度为0．1 mol/L氢氧化钠碱性条件下60℃水浴避光反应5 min后，衍生产物用环己烷萃取1 min效果最佳。结论该荧光衍生化条件温和、反应速度快，DNS-Cl可以应用于异丙酚的衍生化。

关键词:异丙酚;丹磺酰氯;荧光衍生化

异丙酚为烷基酚类短效麻醉药，理想的静脉麻醉和镇静药，通常用作麻醉诱导及维持，具有起效快、麻醉作用强等优点［1］。异丙酚血药浓度与药效之间有密切的关系，通过监测其血药浓度，可以调整给药方案，达到理想的麻醉深度，指导临床合理用药［2］。因而检测异丙酚尤为重要。异丙酚有紫外吸收和荧光特性，因而最长常用测定方法为高效液相色谱荧光或紫外检测［3-8］。其他方法有微乳液相色谱［9］、气相色谱(GC)［10］、高效液相色谱串联质谱(HPLC-MS)［11］、气相色谱-质谱联用(GC-MS)［12］、毛细管胶束电泳法等［13］。在检测血浆中异丙酚时，血浆中内源性物质在异丙酚检测波段有所干扰，所以不直接使用紫外或者荧光法进行检测，而是色谱分离后再进行检测。目前没有相关文献将DNS-Cl用于异丙酚荧光衍生化研究，因而本文选用DNS-Cl作为衍生化试剂对异丙酚荧光衍生化加以研究，能使异丙酚的激发或发射波长红移从而避免干扰，考察异丙酚衍生化反应最佳条件，为直接使用荧光光谱法检测血浆中异丙酚奠定基础，现报道如下。

1　材料与方法

1．1仪器与试剂RF-5301荧光分光光度计、UV-2550紫外可见分光光度计(日本岛津公司);HH-S4数显恒温水浴锅(金坛市医疗仪器厂);PB-10 PH 计(德国赛多利斯集团);AB-135S电子分析天平(天津赛多利斯天平有限公司)。丙泊酚注射液(10mg/mL，四川国瑞药业有限公司，批号: 1211094)，丹磺酰氯(纯度≥98%，上海源叶生物科技有限公司，批号:WS0912EA14)，环己烷(天津市致远化学试剂有限公司，批号:20130121)，乙腈(天津市福晨化学试剂厂，批号:20140507)，氢氧化钠(天津市盛奥化学试剂有限公司，批号:20140926)，正辛烷(天津市百世化工有限公司，批号: 20130917)，正己烷(天津市恒远化学试剂制造有限公司，批号:20131004)，以上试剂均为分析纯，实验用水为蒸馏水。

1．2溶液配制

1．2．1异丙酚溶液配制精密量取异丙酚注射剂0．1 mL置10 mL棕色容量瓶，乙腈溶解并定容，摇匀，得0．1 mg/mL异丙酚储备液;再从中精密量取5 mL置25 mL容量瓶，乙腈稀释并定容，摇匀，得20 μg/mL异丙酚乙腈溶液，于4℃保存。

1．2．2DNS-Cl溶液配制精密称量DNS-Cl 80．7 mg置100 mL棕色容量瓶用乙腈溶解并定容，得3×10－3mol/L的DNS-Cl溶液，4℃保存备用。

1．2．3氢氧化钠溶液配制精密称量氢氧化钠0．4 g置100 mL容量瓶，蒸馏水溶解并定容，摇匀，得0．1 mol/L氢氧化钠溶液。

1．3异丙酚、DNS-Cl、DNS-Cl+NaOH紫外和荧光图谱确定异丙酚乙腈溶液(20μg/mL)、DNS-Cl乙腈溶液(2．4×10－5mol/L)以及在4 mLDNS-Cl乙腈溶液中再加入0．6 mL氢氧化钠溶液，摇匀。分别将这3种溶液以试剂空白为参比在200～700 nm范围内全波长扫描紫外光谱。根据最大紫外吸收波长(λmax)初步确定激发波长(λex)，扫描荧光光谱，确定λex和发射波长(λem)。

1．4 DNS-Cl对异丙酚衍生化反应精密量取异丙酚乙腈溶液(20μg/mL)2．5 mL，置10 mL棕色具塞试管，分别加入DNS-Cl乙腈溶液(3×10－3mol/L)溶液1mL和NaOH溶液(0．1mol/L)0．2mL，振摇充分混匀，于60℃水浴避光反应5 min。加入5 mL环己烷，振摇1 min。取有机层，以试剂空白(异丙酚以相同体积乙腈代替，其余步骤完全一致)为参比200 ～700 m范围内全波长扫描紫外光谱。根据最大紫外吸收波长(λmax)初步确定产物λex，扫描荧光光谱，确定产物λex和λem，测定其荧光强度(F)，反应方程式见图1。

图1　丹磺酰氯对异丙酚衍生化反应

2　结果

2．1产物的确定为确定衍生化产物生成，初步通过紫外和荧光图谱波长变化确定。提前测定异丙酚、DNS-Cl及DNS-Cl加入氢氧化钠溶液后紫外和荧光图谱与衍生产物的加以区分。异丙酚衍生产物λex和λem比异丙酚分别红移了72 nm、200 nm。衍生产物需要萃取，因为DNS-Cl加入氢氧化钠后紫外及荧光图谱发生改变且具有强烈荧光对产物测定产生干扰。为进一步确定萃取后产物单一性，对相应的试剂空白也进行萃取。根据荧光光谱图，可以看出λex=343 nm、λem=500 nm处，空白基本没有信号响应。说明产物萃取后不受DNS-Cl及以及未反应异丙酚的影响。因为DNS-Cl加入氢氧化钠后可能会水解以及异丙酚加入氢氧化钠变为酚盐后水溶性都有增加，脂溶性萃取溶剂不能将它们萃取出来，见表1、图2。

2．2衍生化反应条件的考察采用单因素变量法，考察DNS-Cl对异丙酚衍生化反应条件。包括DNSCl和异丙酚溶剂、反应时间、温度、衍生试剂用量及产物萃取溶剂和萃取时间。测定萃取后产物以试剂空白为参比在λex=343 nm、λem=500 nm处F值为参考，考察以上条件。

表1　各物质的λm ax、λex、λem/nm

图2　衍生产物及空白荧光光谱图

2．2．1 DNS-Cl和异丙酚溶剂的考察对异丙酚和DNS-Cl溶剂进行考察，包括乙腈、甲醇、丙酮。3种溶剂均可溶解，但以丙酮为溶剂时其本身有紫外吸收且没有找到合适溶剂能与丙酮很好的分层产物无法萃取。以甲醇做溶剂时，发现DNS-Cl与甲醇可能发生某种反应，溶解后DNS-Cl溶液随时间放置溶液颜色变浅。最终以乙腈为溶剂。

2．2．2反应时间的考察对衍生化反应分别进行3、5、10、15、20、30 min考察。结果反应在5 min衍生产物F值最大，继续延长反应时间并没有明显改变，故以5 min为反应最佳时间，见图3。

图3　反应时间的考察

2．2．3反应温度的考察考察衍生化反应分别在30、40、50、60、70℃不同温度下反应，温度在60℃时F值最大，温度继续升高F值下降。可能随着温度的增高，DNS-Cl水解速度也相应加快，与异丙酚反应程度有所降低，故以60℃作为反应最佳温度，见图4。

2．2．4衍生试剂用量的考察对DNS-CL与异丙酚摩尔比分别为1～10倍进行考察，随DNS-Cl用量增加F值也随之增加，当摩尔数为异丙酚的约8倍以上时F值基本稳定，变化不大。故DNS-Cl的量为异丙酚8倍时为衍生试剂用量，见图5。

图4　反应温度的考察

图5　丹磺酰氯用量考察

2．2．5产物萃取试剂的考察反应后分别使用环己烷、正己烷、正辛烷萃取产物进行考察。环己烷、正辛烷、正己烷萃取后产物F值分别为119．363、80．037、70．676，表明当以环己烷为萃取溶剂时，产物萃取比较完全，故选择环己烷作为萃取最佳溶剂。

2．2．6衍生产物萃取时间的考察反应后加入环己烷，分别振摇0．5、1．0、1．5、2．0 min后对萃取时间考察。萃取时间分别为0．5、1．0、1．5、2．0 min时，产物F值分别为119．064、127．500、120．965、125．768，可以看出不同萃取时间F值变化并不明显，1 min 时F值最大，故选择1 min作为产物萃取时间。

3　讨论

本文研究了以DNS-Cl作为荧光衍生化试剂对异丙酚进行荧光衍生化并对条件加以考察。该衍生反应在碱性条件下，60℃避光反应5 min，条件温和且反应速度较快。反应中加入氢氧化钠溶液是因为异丙酚为弱酸性，加入强碱可产生酚盐增加反应活性，促进产物生成。DNS-Cl对异丙酚衍生化能够达到异丙酚荧光检测波长红移的目的，产物发射波长在500 nm，比异丙酚(300 nm)红移了200 nm。对产物稳定性做了相关研究发现，产物在0～10min基本稳定，F值并没生明显变化，随时间进一步延长F值增加明显。针对这一现象，本研究又进一步增加衍生化反应时间，萃取后立即测定F值仍与反应5min的接近，提高温度加剧反应条件F值有所下降，但放置后F值仍增加，对于产物稳定性问题还需进一步研究和探讨。研究还发现虽然衍生化后荧光检测波长有所红移，但产物荧光强度反而不如异丙酚衍生化之前。可能该反应为衍生化试剂与异丙酚酚羟基发生亲核反应，从异丙酚结构可以看出，酚羟基两侧还有两个异丙基具有一定的空间位阻，使反应程度大大降低。DNS-Cl加入氢氧化钠后具有强烈荧光对衍生产物测定有影响，必须将产物萃取出来。且反应及衍生化产物要避光，荧光检测本来就易受外界条件干扰，应用时不易控制。

参考文献:

［1］Lee SY，Park NH，Jeong EK，etal．Comparison of GC/MSand LC/ MSmethods for the analysisof propofol and itsmetabolites in urine ［J］．JChromato B Analyt Technol Biomed Life Sci，2012，900: 1-10．

［2］宋宇红，唐丽琴，胡世林，等．HPLC法测定人血浆中丙泊酚浓度［J］．中国药师，2013，16(7):993-995．

［3］陈宁，赵恒利，徐竞鸥．高效液相色谱-荧光法测定丙泊酚的血浆浓度［J］．中国药学导报，2008，5(25):13-16．

［4］Knibbe CA，Koster VS，Deneer VH，etal．Determination of propofol in low-volume samples by high-performance liquid chromatography with fluorescence detection［J］．JChromatogr B Biomed Sci Appl，1998，706(2):305-310．

［5］杨万超，耿英杰，张艺楠，等．高效液相色谱法同时测定人血浆丙泊酚和利多卡因浓度［J］．哈尔滨医科大学学报，2011，45 (3):240-243．

［6］Teshima D，Nagahama H，Makino K，etal．Microanalysis of propofol in human serum by semi-microcolumn high-performance liquid chromatography with UV detection and solid-phase extraction［J］．JClin Pharm Ther，2001，26(5):381-385．

［7］蔡美华，朱玲，王珊娟，等．反相高效液相色谱-荧光法测定血浆中丙泊酚的浓度［J］．中国药房，2003，14(12):30-32．

［8］张延柳，宫玉蕾，张奇，等．用RP-HPLC法测定人血浆中丙泊酚浓度［J］．药学服务与研究，2013，13(5):373-376．

［9］张婷，崔颖．微乳液相色谱法测定人血浆中的丙泊酚［J］．色谱，2011，29(8):768-772．

［10］Laurila T，Sorvajarvi T，Saarela J，etal．Optical detection of the anesthetic agent propofol in the gas phase［J］．Anal Chem，2011，83(10):3963-3967．

［11］Bajpai L，Varshney M，Seubert CN，etal．A new method for the quantitation of propofol in human plasma:efficient solid-phase extraction and liquid chromatography/APCI-triple quadrupole mass spectrometry detection［J］．JChromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2004，810:291-296．

［12］曹兴华，郑宏，王江，等．气相色谱-质谱法测定丙泊酚血浆和全血浓度的比较［J］．临床麻醉学杂志，2004，20(7): 405-407．

［13］陈静，袁爱武，刘绍乾，等．毛细管胶束电泳法测定血浆异丙酚方法的研究［J］．实用预防医学，2004，11(4):705-707．

(本文编辑施洋)

Study on preparation process of propofol fluorescence derivatization by dansyl chloride

LIYing，LI Li
(School of Pharmacy，Xinjiang Medical University，Urumqi 830011，China)

Abstract:Objiective To explore preparation process of fluorescence derivatization for propofol by using dansyl chloride as derivatization reagent．M ethods Utilize the reaction of propofol and the DNS-Cl to obtain a fluorescent derivative product which was detected by fluorospectrophotometry．And investigate derivatization conditions by single-factor variablemethod．Results The results of derivatization indicated that the derivatives could be obtained by the labeling reaction of DNS-Clwith propofol(DNS-Cl:propofol=8:1 inmole ratio)in the presence of sodium hydroxide(0．1 mol/L)at 60℃for 5 min in the dark，then using cyclohexane to extract for 1min．Conclusion DNS-Cl could be applied to derivatize for propofol，the reaction condition wasmild and the reaction velosity is fast in the fluorescence derivatization．

Keywords:propofol;dansyl chloride;fluorescence derivatization

［收稿日期:2015-12-6］

通信作者:李莉，女，博士，教授，博士生导师，研究方向:药物分析，E-mail:llxjmu@163．com。

作者简介:李莹(1990－)，女，在读硕士，研究方向:药物分析。

基金项目:国家自然科学基金(81260485)

doi:10．3969/j．issn．1009-5551．2016．03．013

中图分类号:R914

文献标识码:A

文章编号:1009-5551(2016)03-0316-04