Tim-3/Galectin-9与Th1/Th2相关因子在人细粒棘球蚴感染中的表达研究

赵　慧，张峰波，庞楠楠，朱玥洁，向　阳，吴梦茹，辛　燕，马秀敏，，丁剑冰，(新疆医科大学第一附属医院医学检验中心，乌鲁木齐　830054;新疆包虫病基础医学重点实验室，乌鲁木齐　8300)



Tim-3/Galectin-9与Th1/Th2相关因子在人细粒棘球蚴感染中的表达研究

赵慧1，张峰波1，庞楠楠1，朱玥洁1，向阳1，吴梦茹2，辛燕2，马秀敏1，2，丁剑冰1，2
(新疆医科大学1第一附属医院医学检验中心，乌鲁木齐830054;2新疆包虫病基础医学重点实验室，乌鲁木齐830011)

摘要:目的探讨人细粒棘球蚴感染中Tim-3/Galectin-9与Thl/Th2的平衡关系及其与该疾病发生、发展的关系。方法用实时荧光定量PCR法分别检测30例慢性细粒棘球蚴感染者和30例健康体检人群外周血中Tim-3、Galectin-9、T-bet和GATA-3mRNA的表达，同时用酶联免疫吸附(ELISA)法检测慢性细粒棘球蚴感染者和健康对照者血清中可溶性Tim-3和Galectin-9及IFN-γ、IL-12和IL-4的水平。结果(1)实时荧光定量PCR检测结果显示:与健康对照组相比，感染组Tim-3和Galectin-9 mRNA水平显著升高，T-betmRNA水平显著降低，GATA-3 mRNA水平显著升高。(2)ELISA检测结果显示:与健康对照组相比，感染组血清中可溶性Tim-3和Galectin-9水平显著升高，IFN-γ和IL-12水平显著下降，IL-4水平显著升高。Tim-3与Galectin-9呈正相关(P=0．000，r=0．776); Tim-3与T-bet呈负相关(P=0．000，r=－0．645);Tim-3与GATA-3呈正相关(P=0．000，r=－0．752)。结论

Tim-3/Galectin-9在人细粒棘球蚴持续性感染中发挥一定的作用，Tim-3/Galectin-9可能通过影响Th1/Th2相关的转录因子T-bet/GATA-3和细胞因子IL-12、IFN-γ和IL-4的水平变化，促进Th1/Th2细胞失衡现象的发生，从而促进感染的持续性发展。

关键词:细粒棘球蚴感染;Tim-3/Galectin-9;Th1/Th2;相关因子

囊型包虫病也被称为细粒棘球蚴病，是由细粒棘球绦虫(Echinococcus granululosus，Eg)的幼虫寄生于人、羊等中间宿主引起的人畜共患病［1］。早期研究发现Th1/Th2细胞的失衡是细粒棘球蚴感染过程中重要的免疫学改变［2－3］。感染初期以Th1型为主，感染中后期，逐渐向Th2型转变，使得细粒棘球蚴能长期在宿主体内寄生，最终形成慢性感染。含T细胞免疫球蛋白及黏蛋白结构域的分子3(T cell immunoglobulin andmucin domain containingmolecule-3，Tim-3)是对免疫应答具有抑制性调节作用的分子，对T细胞的细胞凋亡和免疫耐受进行调节［4］。半乳糖凝集素9(Galectin-9)是Tim-3的配体，与临床关系密切，在急性炎症、过敏及慢性炎症中有重要作用［5］。Kuchroo等［6］研究表明Tim-3和Galectin-9两者相互作用可抑制Th1型免疫细胞产生，抑制Th1相关细胞因子γ-干扰素(IFN-γ)、白细胞介素-12(IL-12)表达下降，产生抑制信号，导致Th1细胞凋亡。另外，Han等［7］研究发现体内Tim-3可以促进Th2细胞相关细胞因子的分泌，故以此影响Th1/Th2的平衡关系。

本研究通过采用实时荧光定量PCR方法检测慢性细粒棘球蚴感染者血中Tim-3、Galectin-9、Th1的转录因子T-bet和Th2的转录因子GATA-3 mRNA的表达，采用酶联免疫吸附(ELISA)法检测慢性细粒棘球蚴感染者血清中Tim-3、Galectin-9和Thl/Th2相关因子IFN-γ、IL-12和IL-4的水平，旨在探讨人细粒棘球蚴感染中Tim-3/Galectin-9与Thl/ Th2的平衡关系及其对该疾病发生、发展的作用，以期能为后续发病机制研究和临床治疗提供理论和实验基础。

1　资料与方法

1．1研究对象选择2013年10月－2014年10月在新疆医科大学第一附属医院消化血管外科中心肝胆包虫外科住院的确诊慢性细粒棘球蚴感染者30例为感染组，细粒棘球蚴感染的诊断由病史、临床表现、实验室和影像学检查证实，包虫诊断金标法阳性，初次手术，且为无复发无胆漏、无慢性感染病及其他肝胆系统相关疾病;健康对照组为体检健康者30例，均排除合并其他病毒、细菌等慢性感染及肝胆系统相关疾病，或其他重大疾病，无酗酒史。本研究所涉及的所有实验内容已通过新疆医科大学第一附属医院伦理委员会审查，均征得受试者的知情同意。

1．2材料凝胶成像仪(美国BIO-RAD公司)，PCR扩增仪(美国BIO-RAD公司)，实时荧光定量PCR扩增仪(美国BIO-RAD公司)，离心机(德国eppendorf-5415R)，酶标仪(美国BIO-RAD公司)，Trizol(美国Invitrogen公司)，Revert Aid TM First strand cDNA synthesis Kit(加拿大Fermentas公司)，SYBR Green PCR premix(美国Invitrogen公司)。

1．3方法

1．3．1标本采集慢性细粒棘球蚴感染者于入院后第2天，采集EDTA抗凝血3mL和不抗凝血3mL，新鲜抗凝血为提取总RNA实时荧光定量PCR检测用，不抗凝血用低速离心机离心(20～25℃，3 000 r/min离心5min)，取血清－20℃冻存待ELISA检测用。健康对照组标本采集及处理同上。

1．3．2实时荧光定量PCR法测定人全血中Tim-3、Galectin-9、T-bet、GATA-3mRNA的表达。

1．3．2．1引物设计和合成从GeneBank中检索人Tim-3、Galectin-9、T-bet、GATA-3和β-actin基因引物序列，应用DNAMAN软件设计引物，引物由上海生工生物公司合成(表1)。

表1　引物

1．3．2．2方法用TRIZOL试剂盒提取新鲜抗凝全血总RNA，用反转录试剂盒Revert Aid TM First strand cDNA synthesis Kit将RNA反转录为cDNA(具体操作按说明书)。实时荧光定量PCR总反应体系20μL:2×SYBR Green PCR Master Mix 10μL、反转录cDNA 2μL、上游与下游引物各0．5μL(表1)、ddH2O 7μL。反应条件:50℃2 min(UDG孵育)，95℃2 min，95℃15 s，60℃30 s，共40个循环。结果分析:采用2－ΔΔCt相对定量法，确定特定荧光域值对应循环数的Ct值，对目标基因定量。

1．3．3 ELISA法检测人血清Tim-3、Galectin-9、IFN-γ、IL-12和IL-4的水平严格按照ELISA试剂盒说明书操作，分别检测人血清Tim-3、Galectin-9、IFN-γ、IL-12和IL-4的水平。酶标仪450 nm处读吸光度(OD)值，根据标准曲线计算Tim-3、Galectin-9、IFN-γ、IL-12和IL-4的浓度。

1．4统计学处理采用SPSS17．0软件进行统计学处理，数据以均数±标准差(±s)表示，采用成组t检验和单因素方差分析，以P＜0．05为差异有统计学意义。

2　结果

2．1实时荧光定量PCR结果与健康对照组相比，感染组Tim-3mRNA水平显著升高(P=0．012)，Galectin-9mRNA水平显著升高(P=0．036)，T-bet mRNA水平显著降低(P=0．000)，GATA-3 mRNA水平显著升高(P=0．032)(表2)。

2．2 ELISA法检测结果与健康对照组相比，感染组血清中Tim-3水平显著升高(P=0．001)，Galectin-9水平显著升高(P=0．009)，IFN-γ水平显著下降(P=0．042)，IL-12水平显著下降(P=0．036)，IL-4水平显著升高(P=0．000)(表3、图1、图2)。

表2　Tim-3、Galectin-9、T-bet和GATA-3的mRNA表达?

图1　血清中Tim-3和Galectin-9表达水平

图2　血清中IFN-γ、IL-12和IL-4表达水平

表3　血清中因子表达水平?

2．3相关性分析将Tim-3 mRNA结果与Galectin-9、T-bet和GATA-3mRNA结果做直线相关分析，发现Tim-3与Galectin-9呈正相关(P=0．000，r=0． 776);Tim-3与T-bet呈负相关(P=0．000，r= －0．645);Tim-3与GATA-3呈正相关(P=0．000，r= －0．752)，见图3。

图3　Tim-3与Galectin-9、T-bet和GATA-3的mRNA相关性分析

3　讨论

宿主在感染细粒棘球绦虫后，表达出2种免疫效应:一方面是Thl介导的细胞免疫，可抑制病原体在体内的生长和致病作用;另一方面为Th2介导的体液免疫，产生免疫抑制或免疫耐受，导致机体不能及时有效地清除病原体，使病原体在宿主体内长期存在并发育。前期研究发现慢性细粒棘球蚴感染过程中发生了Thl/Th2免疫失衡现象，属于Th2优势应答的免疫反应，存在Th2细胞的免疫偏移［2－3］。

Tim-3是对免疫应答具有抑制性调节作用的分子，可通过抑制T细胞的活化和增殖来负调控免疫应答［4］。近年来，有关Tim-3/Galectin-9在人类感染性疾病发生中的作用研究逐渐开展。研究证实Tim-3/Galectin-9通路能负调控Thl免疫反应。慢性HCV感染中，阻断Tim-3及其配体的相互作用，可增强HCV特异性CD8+T细胞增殖的能力以及细胞因子IFN-γ的产生［8］。血吸虫感染病变过程也与机体的Th1和Th2的平衡状态有关［9］，抑制Tim-3/ Galectin-9结合，对于血吸虫感染宿主体内的Th2免疫极化可以起到一定程度的抑制作用［10］。

本课题组前期研究检测了肝棘球蚴感染者血清中Tim-3/Galectin-9的变化，发现感染者体内Tim-3/ Galectin-9水平增加，且与Th1相关细胞因子IFN-γ有关，推测Th1/Th2失衡与其有关［11］。故本研究选择慢性细粒棘球蚴感染者，进一步检测其血液中Tim-3/Galectin-9和Th1/Th2转录因子T-bet/GATA-3 mRNA水平的变化，结果发现感染者Th1/Th2失衡的同时，体内Tim-3/Galectin-9mRNA的表达也发生显著变化。Tim-3和Galectin-9 mRNA的水平均明显升高，且Tim-3 mRNA水平的变化与T-bet呈负相关，与GATA-3呈正相关。HBV感染研究结果发现，感染者体内Tim-3/Galectin-9 mRNA水平升高，与Th1/Th2细胞的平衡关系变化有关［12］。故本研究推测Tim-3与Galectin-9结合后可能引起Th1转录因子T-bet表达水平下调，从而影响Th1/Th2细胞的平衡关系，提示Tim-3/Galectin-9可能参与了人细粒棘球蚴感染的免疫调节。

感染免疫中，Th1细胞的活化和相关细胞因子的产生影响着宿主的免疫应答结果［13］。本研究结果显示，感染者血清中可溶性Tim-3和Galectin-9水平均显著升高，IFN-γ和IL-12水平显著下降，IL-4水平显著升高。William等［14］研究发现人CD4+T细胞表面的Tim-3可以下调Th1和Th17等细胞相关细胞因子的产生。Th1和Th2细胞生长发育受周围环境中细胞因子的影响，其中IL-12和IL-4有决定性作用。IL-12可诱导Th0向Th1细胞分化，诱导Th1细胞分泌IL-2和IFN-γ，IL-4可诱导Th0向Th2细胞分化［15］。因此，本研究推测人细粒棘球蚴感染过程中负性分子Tim-3和Galectin-9的表达上调抑制了IL-2的产生，促进了IL-4的分泌，从而抑制Th1细胞的分化和IFN-γ的产生，使免疫应答由Th1逐渐向Th2转化，最终机体呈现出以Th2细胞为主的优势应答。另外，Tim-3与其配体Galectin-9相结合可诱导活化的Th1型细胞凋亡，有利于外周免疫耐受形成。故利于细粒棘球蚴在体内的长期存活和生长，逐渐形成慢性感染。研究发现HBV的持续性感染与Th1/Th2免疫偏移有关，且Tim-3参与其中，Tim-3的过度表达促使HBV感染的发展［16］。因此，Tim-3/Galectin-9在人细粒棘球蚴持续性感染中发挥一定的作用，Tim-3/Galectin-9可能通过影响Th1/ Th2相关的转录因子T-bet/GATA-3和细胞因子IL-12、IFN-γ和IL-4的水平变化，促进Th1/Th2细胞失衡现象的发生，从而促进感染的持续性发展。

综上，Tim-3/Galectin-9在调节免疫细胞的动态平衡和慢性感染性疾病中起着重要的作用，可能是预防和控制人细粒棘球蚴感染发生、发展的一个新靶点。本课题组将继续开展一系列相关研究以明确Tim-3/Galectin-9在人细粒棘球蚴感染中的作用，以期今后为新疆地区包虫病的诊疗研究提供理论基础。

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(本文编辑王艳)

·药学研究·

The expression of Tim-3/Galectin-9 and Th1/Th2 related factor in patients w ith Echinococcus granululosus infection

ZHAO Hui1，ZHANG Fengbo1，PANG Nannan1，ZHU Yuejie1，XIANG Yang1，WU M engru2，XIN Yan2，MA Xium in1，2，DING Jianbing1，2
(1Medical Examination Center，The First Affiliated Hospital，Xinjiang Medical University，Urumqi830054，China;2Key Laboratory of Xinjiang Echinococcosis Based Medicine，The First Affiliated Hospital，Xinjiang Medical University，Urumqi830011，China)

Abstract:ObjectiveTo explore role of relationship between Tim-3/Galectin-9 and Thl/Th2 balances in Echinococcus granululosus infected development by studying relationship between Tim-3，Galectin-9 and Th1/Th2 related transcription factors T-bet/GATA-3 and related cytokines IFN-gamma，IL-12，IL-4 in peripheral blood．M ethods Utilize the real-time quantitative PCR technique to detect Tim-3，Galectin-9，T-betand GATA-3mRNA expression in 30 cases of chronic Echinococcusgranululosus infection patients vs 30 cases of healthy control．At the same time，use enzyme linked immunosorbent assay(ELISA)method to detect the levels of serum soluble Galectin-9，Tim-3，IFN-gamma，IL-12 and IL-4 in chronic Echinococcus granululosus infection patients and healthy control respectively．Results(1)RT-PCR detection showed that compared with healthy control，themRNA levels of Tim-3 and Galectin-9 in chronic infection group were increased significantly;ThemRNA level of T-bet is decreased significantly;ThemRNA level of GATA-3 is increase significantly．(2)ELISA test showed that compared with healthy control，the chronic infection group serum soluble Galectin-9 and Tim-3 levels increased signifi-book=313,ebook=63cantly;IFN-gamma and IL-12 levels decreased significantly;IL-4 levels increased significantly．(3)Tim-3 was positively correlated with Galectin-9(P=0．000，r=0．776);Tim-3 and T-bet were negatively correlated(P=0．000，r=－0．645);Tim-3 and GATA-3were positively correlated(P=0．000，r=－0．752)．Conclusion Tim-3/Galectin-9 play an important role in Echinococcusgranululosus persistent infection，and Tim-3/Galectin-9may promote the imbalance of Th1/Th2 cells by affecting Th1/Th2 related transcription factors T-bet/GATA-3 and cytokine IL-12，IFN-gamma and IL-4 levels to promote the sustainable development of the infection．

Keywords:Echinococcus granululosus infection;Tim-3/Galectin-9;Th1/Th2;related cytokines

［收稿日期:2015-07-20］

通信作者:丁剑冰，女，教授，博士生导师，研究方向:医学免疫，E-mail:djbing002@163．com。

作者简介:赵慧(1986－)，女，硕士，检验技师，研究方向:感染免疫。

基金项目:新疆医科大学第一附属医院院内自然科学基金(2013ZRQN24);国家自然科学基金(81460307)

doi:10．3969/j．issn．1009-5551．2016．03．012

中图分类号:R383．33

文献标识码:A

文章编号:1009-5551(2016)03-0312-05