胆固醇酯转运蛋白抑制剂的分子设计

刘炳旺，马英，李彬寒，王润玲

（1.天津医科大学药学院，天津市临床药物关键技术重点实验室，天津300070；2.天津医科大学肿瘤医院分子影像及核医学诊疗科，国家肿瘤临床医学研究中心，天津市“肿瘤防治”重点实验室，天津 300060）

论著

胆固醇酯转运蛋白抑制剂的分子设计

刘炳旺1，2，马英1，李彬寒1，王润玲1

（1.天津医科大学药学院，天津市临床药物关键技术重点实验室，天津300070；2.天津医科大学肿瘤医院分子影像及核医学诊疗科，国家肿瘤临床医学研究中心，天津市“肿瘤防治”重点实验室，天津 300060）

目的：设计针对胆固醇酯转运蛋白(CETP)的抑制剂，提高其降低血脂水平，为以后相关疾病的治疗提供科学的方法和依据。方法：以现有torcetrapib抑制剂为模板，利用Schrodinger Suite 2009软件中的“Core Hopping”模块进行修饰，对修饰后的结构用“Core Hopping”模块改造结构；利用Schrodinger Suite2009中的Glide模块对druglike数据库中10万个化合物进行高通量虚拟筛选，得到结构进行修饰。利用Glide模块对所建立的化合物库进行虚拟筛选。应用Qikprop模块做ADME（吸收、分布、代谢、排泄）预测来推测这些化合物的成药可能性。结果:对torcetrapib结构进行修饰，得到8个较好的化合物；通过对druglike数据库进行高通量虚拟筛选得到1个化合物-ZINC26608950，修饰后得到6个化合物。用分子对接方法分析了新抑制剂和CETP的相互作用机制，与现有的抑制剂torcetrapib相比有更好的结合能力。通过ADME预测得出设计出的化合物均符合类药5原则。结论：通过两种方法得到14个CETP抑制剂，分子对接初步证明其可以抑制CETP，此为CETP抑制剂的结构改造及活性测定奠定了基础。

胆固醇酯转运蛋白；抑制剂；药物设计；分子对接

心血管疾病具有“发病率高、致残率高、死亡率高、复发率高、并发症多”的特点[1-2]，严重危害到人类健康，已位于人类死亡病因之首，而高血压、冠状动脉粥样硬化是其病因之一。研究治疗冠状动脉粥样硬化药物对预防和治疗心血管疾病有着重要意义[3]。研究发现胆固醇酯转运蛋白（CETP）可作为治疗动脉硬化的新靶点，一个基因突变致CETP缺乏的家系，高密度脂蛋白（HDL）水平升高，同时冠心病发病率明显下降，并且当抑制CETP的活性时，能有效提高血浆内HDL含量水平[4-6]，所以CETP抑制剂被认为是冠状动脉粥样硬化(AS)最有治疗潜力的药物之一[7-12]。本研究旨在通过两种方法-高通量虚拟筛选和结构修饰的方法设计出新的CETP抑制剂。

1 材料与方法

1.1 材料 软件及数据库在DELL T5500计算工作站上进行操作，涉及的软件为Schrodinger 2009，模块包括 ligPrep,QikProp,Combiglide,Glide。在ChemBioOffice2010上进行绘图，片段分子来自已有碎片库。受体来自PDBbank数据库。

1.2 方法

1.2.1 受体结构的准备 蛋白结构预处理由Schrodinger Suite 2009软件中的Protein preparation wizard模块完成。首先对CETP蛋白质结构（PDB ID:4EWS）[13]进行修正，包括修正化学键，加氢，处理金属离子，修正N端和C端的残基结构错误，除去蛋白质晶体结构中的水分子和杂原子，只保留蛋白分子与原始配体。再对蛋白质氢键进行优化，优化参数为Sample water orientations，优化力场选择OPLS 2005[14]，以RMSD 0.5 Å为收敛标准。

1.2.2 盒子的产生 以原始配体小分子torcetrapib为中心，大小选择为11Å生成对接盒子文件。为确保盒子文件能够适合模拟体系，对盒子文件进行验证。本实验通过将小分子torcetrapib对接到CETP（4EWS）的配体结合区，再重新与晶体结构中的配体构象叠合比对来验证对接方法和盒子文件的选择是否合理。

1.2.3 配体准备 对分子进行配体优化处理，此步在 LigPre模块中完成。小分子优化的力场为OPLS_2005，产生pH值7.0±2.0下的离子化状态，去盐，产生各种可能的互变异构体。

1.2.4 分子对接 应用Glide[15]模块进行分子对接。以原始配体小分子为盒子中心，大小为11×11×11Å自动生成对接盒子文件。虚拟筛选中对接精度为HTVS（高通量筛选）。对接精度为SP（标准精度），采用柔性对接，柔性对接时要求考虑各种环的柔性情况，要求对接函数在打分时对非平面型的酰胺键构象进行罚分，其它参数为默认值。

1.2.5 结构修饰 “Core Hopping”模块具有片段替换和分子刚性对接两大功能，可以发现全新的拓扑结构骨架和活性分子。在“Core Hopping”过程中，第一步是定义模板化合物，在Define Combinations step中定义需要替换的片段。第二步将定义好的受体盒子导入Receptor grid file中。第三步导入分子片段，分子片段来自于实验室已有片段数据库和软件中自带的片段数据库。小分子片段会自动连接到母核上生成新的化合物数据库，得到的化合物数据库与受体进行刚性对接。依据对接得分进行下一步筛选，得分的绝对值越大，配体与受体的亲和力越强，结合力越好。

1.2.6 ADME预测 QikProp模块可以预测化合物，可以对整个分子的3D结构预测，预测性质包括：辛醇/水和水/气体的log Ps,log S,log BB；整个CNS活性；Caco-2和MDCK细胞渗透性；血清白蛋白结合活性log Khsa；HERG的K离子通道阻断性log IC50。本实验对logPo/w、PSA、logS和PMDCK进行了预测。

2 结果

2.1 对接方法验证 对接后的结构与晶体中配体原始构象的均方根偏差（RMSD）值为0.8 Å。说明盒子文件能够适用模拟体系。图 1为 CETP与torcetrapib的结合模式图。

图1 CETP与compound1、torcetrapib的结合模式图Fig 1 The conformation obtained by docking torcetrapib and compound1 to CETP

2.2 CETP抑制剂

2.2.1 对torcetrapib结构进行修饰 本实验选取torcetrapib作为结构修饰的母核。具体修饰过程如图2所示：首先对A片段进行替换旨在找到结合更强的片段，找出2个优选片段A1、A2。然后，对B片段进行替换以期找到疏水作用更强的片段，找出4个优选片段B1、B2、B3、B4。这样就产生了2×4=8个化合物。根据这个分子修饰的原则，表1中列出了修饰后的8个torcetrapib的类似物分子，包括torcetrapib本身在内的对接结果。

图2 以torcetrapib为母核的结构修饰流程图Fig 2 A flowchart to show the agonists design process of torcetrapib

2.2.2 高通量虚拟筛选 对druglike[16]数据库中10 000个化合物进行筛选，选出能与受体CETP的4个结合口袋结合的化合物最后得到1个化合物ZINC26608950。此化合物能结合到第2,3,4口袋。由此，选ZINC26608950作为进一步修改的候选化合物。ZINC26608950的缺点是没有向CETP受体的第一结合空腔延伸，没能与CETP受体结合区形成较好的匹配，所以可以尝试设计出能够占据CETP受体4个结合区的高效抑制剂。对此结构应用“Core Hopping”进行结构改造得出6个较好的结构,见表1。具体修饰过程如图3所示：在环上添加分子片段以提高与受体的疏水区的匹配性，找出6个优选片段R1、R2、R3、R4、R5和R6。对接结果显示：分子结构与CETP具有较好的匹配性。图4为torcetrapib、comp-vs#1与CETP结合模式图。

图3 对ZINC26608950的结构修饰流程图Fig 3 A flowchart to show the agonists design process of ZINC26608950

图4 Torcetrapib、comp-vs#1与CETP结合模式图Fig 4 The conformation obtained by docking torcetrapib and comp-vs#1 to CETP

2.3 ADME预测结果 应用Schrodinger2009软件包中的QikProp模块对与药效相关的5个性质进行预测。结果如表1所示。新设计的化合物的logPo/w、PSA、logS、PMDCK均在合理的范围内。

表1 ADME预测和对接得分Tab 1 Physiochemical descriptors calculated by QP and docking score

3 讨论

3.1 CETP受体抑制剂的设计 靶点的选择对化合物的设计起到至关重要的作用。CETP靶点蛋白晶体结构从布鲁克海文蛋白数据库下载，遵循以下条件：所选靶点晶体结构为人源的；晶体结构中氨基酸残基没有突变；晶体结构分辨率小于2.6Å[17]。

Torcetrapib[18]是由美国辉瑞公司研发的第一个CETP抑制剂，也是第一个进行大规模终点事件评价临床试验的CETP抑制剂。torcetrapib使收缩压升高约5 mmHg，同时升高血钠、碳酸氢盐及醛固酮水平。似乎这些脱靶效应导致了死亡率的增加，后续研究显示这些不良作用与CETP抑制机制无关，即其他CETP抑制剂不一定有这样的作用。CETP抑制剂torcetrapib具有高脂溶性（cLogP=8.395），极低水溶性，这就使化合物产生了脱靶现象。torcetrapib有两点不符合成药五规则：分子质量超过500和高脂溶性。所以在设计化合物的时候要避免此现象产生。现今，一个成功用作口服药物的化合物必须具有足够的水溶性，以及和其临床药效相关的通透性。准确的ADME预测对进一步合成起到指导作用。本实验设计的化合物 logPo/w、PSA、logS、PMDCK均在合理的范围内。尽管logPo/w越高，结合能力越强，但不能过度地增强logPo/w水平，这样会导致药物在体内分布较差。这些化合物的创新性在于不仅均符合成药五规则还能与CETP有很好的相互作用，在理论上这些化合物的结合能力超过torcetrapib。

分子对接初步证明其可以抑制CETP，具有理论活性，表明基于CETP治疗冠状动脉粥样硬化具有一定可行性，为治疗冠状动脉粥样硬化的先导化合物的结构改造及活性测定奠定了基础。

[1] Zhang L,Yan F,Zhang S,et al.Structural basis of transfer between lipoproteins by cholesteryl ester transfer protein[J].Nat Chem Biol, 2012,8(4):342

[2] Bishop B M.Systematic review of CETP inhibitors for increasing high-density lipoprotein cholesterol:where do these agents stand in the approval process[J]Am J Ther,2015,22(2):147

[3] Chapman M J,Wilfried L G,Guerin M,et al.Cholesteryl ester transfer protein:at the heart of the action of lipid-modulating therapy with statins,fibrates,niacin,and cholesteryl ester transfer protein inhibitors[J].Eur Heart J,2010,31(2):149

[4] Barter P J,Brewer H B,Chapman M J,et al.Cholesteryl ester transfer protein:a novel target for raising HDL and inhibiting atherosclerosis[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2003,23(2):160

[5] Ding Y Y,Zhang W,Zhang M Q,et al.Functional and association studies of the cholesteryl ester transfer protein (CETP)gene in a Wannan Black pig model[J].Anim Genet,2015,46(6):702

[6] Morton R E,Izem L.Modification of CETP function by changing its substrate preference:a new paradigm for CETP drug design[J].J Lipid Res,2015,56(3):612

[7]杨征,邱敏.丹参酮IIA的心血管作用及机制研究进[J].中国动脉硬化杂志,2011，19（4）:372

[8] Collins H L,Drazul-Schrader D,Sulpizio A,et al.L-Carnitine intake and high trimethylamine N-oxide plasma levels correlate with low aortic lesions in ApoE transgenic mice expressing CETP[J]. Atherosclerosis,2015,244:29

[9] Miyosawa K,Watanabe Y,Murakami K,et al.New CETP inhibitor K-312 reduces PCSK9 expression:a potential effect on LDL cholesterol metabolism[J].Am J Physiol Endocrinol Metab,2015, 309(2):177

[10]Jeenduang N,Porntadavity S,Nuinoon M,et al.Studies of the CETP TaqIB and ApoE polymorphisms in southern thai subjects with the metabolic syndrome[J].Biochem Genet,2015,53（7/8）:184

[11]Hitchcock E,Patankar J V,Tyson C,et al.A novel microdeletion affecting the CETP gene raises HDL-associated cholesterol levels [J].Clin Genet,2015,1

[12]Greene D J,Izem L,Morton R E.Defective triglyceride biosynthesis in CETP-deficient SW872 cells[J].J Lipid Res,2015,56（9）:1669 [13]Liu S P,Mistry A,Jennifer M,et al.Crystal structures of cholesteryl ester transfer protein incomplex with inhibitors[J].J Biol chem,2015, 287（44）:37321

[14]Oostenbrink C,Soares T A,Vander Vegt N F,et al.Validation of the 53A6 GROMOS force field[J].Eur Biophys J,2005,34(4):273

[15]Halgren T A,Murphy R B,Friesner R A,et al.Glide:a new approach for rapid,accurate docking and scoring.2.Enrichment factors in database screening[J].J Med Chem,2004,47(7):1750

[16]Irwin J J,Shoichet B K.ZINC--a free database of commercially availablecompoundsforvirtualscreening[J].JChemInf Model,2005, 45（1）:177

[17]洪渊．基质金属蛋白酶及其抑制剂的分子对接研究[D]．吉林:吉林大学，2007

[18]Morehouse L A,Sugarman E D,Bourassa P A,et al.Inhibition of CETP activity by torcetrapib reduces susceptibility to diet-induced atherosclerosis in NZW rabbits[J].J Lipid Res,2007,48（6）:1263

（2015-10-09收稿）

Designing novel inhibitors by targeting cholesteryl ester transfer protein

LIU Bing-wang1,2,MA Ying1,LI Bin-han1,WANG Run-ling1
（1.School of Pharmacy,Tianjin Medical University,Tianjin Key Laboratory on Technologies Enabling Development of Clinical Therapeutics and Diagnostics,Tianjin 300070,China；2.Department of Molecular Imaging and Nuclear Medicine,Cancer Institute and Hospital,Tianjin Medical University,National Clinical Research Center for Cancer,Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy, Tianjin 300060,China)

Objective：To develop highly active cholesteryl ester transfer protein（CETP）novel inhibitors to facilitate further research.Methods：In this study,torcetrapib was modified by means of“core hopping”;the small molecule drug-like database was screened by Glide of Schrodinger Suite 2009 and then was modified.It was further validated by the outcomes of their ADME (absorption,distribution, metabolism,and excretion)predictions that the new agonists could have high potential to become drug candidates.Results：Eight compounds were discovered to inhibit CETP based on torcetrapib by means of“core hopping”.One CETP inhibitor-ZINC26608950 was discovered by high throughput virtual screening,and 6 compounds were discovered to inhibit CETP based on ZINC26608950.It was observed by docking that these novel inhibitors had more favorable conformation for binding to the receptor than torcetrapib.It was predicted that the values for these novel candidates were all within the reasonable ranges.Conclusion：The binding affinity of the designed molecules is theoretically higher than the torcetrapib in CETP.And the new inhibitors may become potential drug hits.

cholesteryl ester transfer protein;inhibitors;computer aid design drug;molecular docking

R914.2

A

1006－8147（2016）02-0122-04

刘炳旺(1981-)，男，硕士在读，研究方向：计算机辅助药物设计；通信作者：王润玲，E-mail:wangrunling@tijmu.edu.cn。