草石蚕酶法制备低聚木糖及其抗氧化活性研究

2016-05-18史守纪

中国饲料 2016年24期

史守纪

史守纪

（无锡商业职业技术学院，江苏无锡214153）

本试验通过响应面分析法确定了草石蚕酶法制备低聚木糖的工艺条件，即pH为4，加酶量为379 mol/kg，酶解温度为54℃，酶解时间为94 min，此条件下低聚木糖含量达到6.92 mg/mL，与3个对照组相比分别高了15.1%、11.4%、9.5%，差异显著。同时，试验结果表明，低聚木糖对羟自由基和超氧阴离子具有较强清除能力，因此，低聚木糖具有较好的抗氧化活性。

草石蚕；低聚木糖；抗氧化性

草石蚕含有丰富的纤维素和半纤维素，其中半纤维素的主要成分是木聚糖。木聚糖通过酶解法可制备低聚木糖，低聚木糖能够促进有益菌增殖（Courtin，2009；Hesta，2001）。除此之外，低聚木糖还有良好的耐酸和耐热性，是预防龋齿的重要物质成分。另外，有研究发现，低聚木糖还有利于清除体内自由基，有抗氧化功能（扶国才，2009；丁苏，2008）。

目前，低聚木糖提取和生产方法较多，例如酸水解法、热水抽提法、微波降解法和酶水解法。其中酶法制备主要原理是利用内切型木聚糖酶定向酶解木聚糖，杂物较少，从而简化了后续低聚木糖的纯化工艺（隋明，2011）。但在使用酶法制备过程中，要根据不同酶制剂类型选择不同的工艺流程，因此进一步研究采用不同类型酶制备低聚木糖的方法很有必要。本试验以草石蚕酶为原料，采用响应面分析对草石蚕酶低聚木糖制备工艺进行研究，并对其进行优化和改进，以进一步提高低聚木糖纯化水平，进而深入研究低聚木糖的抗氧化活性，为提高草石蚕酶资源利用效率、充分发挥低聚木糖抗氧化活性作用提供参考。

1 材料及方法

1.1 原料与试剂草石蚕：广东省农科院提供；木聚糖酶、邻苯三酚、NaOH等，购买于广州天马试剂公司。

1.2 试验仪器与设备FB45/7冷冻离心机（上海博迅公司）；AL204型电子天平（德国赛多利斯公司）；UV-1900紫外分光光度计（美析仪器）；LZB型超声粉碎仪（上海博迅公司）；HK-2A超级恒温水浴（美析仪器）等。

1.3 试验方法

1.3.1 低聚木糖的酶解法制备工艺流程酶解底物→添加木聚糖酶→调pH值和温度→酶解→木聚糖酶失活→离心→测定还原糖含量（朱浩拥，2011）。

1.3.2 还原糖含量测定还原糖含量测定采用DNS法（王宪泽，2002）。

1.3.3 羟自由基清除能力的测定采用邻二氮菲-Fe2+氧化法测定（Kawasaki，1995）。

1.3.4 超氧阴离子自由基清除能力测定采用邻苯三酚自氧化法测定（Xiao-ming，2009）。

2 结果与分析

2.1 草石蚕酶法制备低聚木糖工艺优化

2.1.1 不同pH对制备低聚木糖效果的影响选取2、3、4、5、6、7六个水平的pH，设定其他各因素条件不变，观察草石蚕酶法制备低聚木糖的效果（吕晓晶，2010）。由图1可以看出，pH为5时，草石蚕酶法制备低聚木糖的效果较好。

图1 不同pH对制备低聚木糖效果的影响

2.1.2 不同加酶量对制备低聚木糖效果的影响选取100、200、300、400、500、600 U/g六个水平的加酶量，设定其他各因素条件不变，观察草石蚕酶法制备低聚木糖的效果（王远，2009）。由图2可以看出，加酶量为400 U/g时，草石蚕酶法制备低聚木糖的效果较好。

图2 不同加酶量对制备低聚木糖效果的影响

2.1.3 不同酶解温度对制备低聚木糖效果的影响选取35、40、45、50、55、60℃六个水平的酶解温度，设定其他各因素条件不变，观察草石蚕酶法制备低聚木糖的效果（丁胜华，2010）。由图3可以看出，酶解温度为50℃时，草石蚕酶法制备低聚木糖的效果较好。

2.1.4 不同酶解时间对制备低聚木糖效果的影响选取20、40、60、80、100、120 min六个水平的酶解时间，设定其他各因素条件不变，观察草石蚕酶法制备低聚木糖的效果（李相前，2008）。由图4可以看出，酶解时间为80 min时，草石蚕酶法制备低聚木糖的效果较好。

图3 不同酶解温度对制备低聚木糖效果的影响

图4 不同酶解时间对制备低聚木糖效果的影响

2.2 响应面分析法确定草石蚕酶法制备低聚木糖工艺条件

2.2.1 模型的建立及显著性检验试验设计见表1。

表1 草石蚕酶法制备低聚木糖的试验因素和水平

分析草石蚕酶法制备低聚木糖的条件可知（表2），pH、加酶量、酶解温度、酶解时间这4个因素都是显著因素。低聚木糖含量的二次回归拟合方程如下：

低聚木糖含量/（mg/mL）=6.38-0.21A-0.42B+ 0.29C+0.33D-0.023AB-0.15AC-0.42AD-0.12BC-0.68BD-0.18CD-0.47A2-0.34B2-0.18C2-0.61D2。

从表3可知，草石蚕酶法制备低聚木糖的试验模型的P值＜0.0001，而且失拟项的P值是0.4623，说明草石蚕酶法制备低聚木糖的试验模型和实际情况拟合度比较好，所以能对草石蚕酶法制备低聚木糖的条件进行预测。

2.2.2 响应面交互作用分析与优化对草石蚕酶法制备低聚木糖的各因素交互作用进行响应面分析，以低聚木糖含量为响应值的曲面图如图5～10所示。

由图5可以看出，pH与加酶量相互作用对制备低聚木糖效果影响显著。随着pH的增大，低聚木糖含量先增后减，且变化幅度较大；随着加酶量的增加，低聚木糖含量先增后减，变化幅度较小。

表2 草石蚕酶法制备低聚木糖的试验结果

表3 回归方程各项的方差

图5 pH和加酶量相互作用对制备低聚木糖效果的影响

由图6可以看出，pH与酶解温度相互作用对制备低聚木糖效果影响显著。随着pH与酶解温度的增大，低聚木糖含量先增后减。

图6 pH和酶解温度相互作用对制备低聚木糖效果的影响

由图7可以看出，pH与酶解时间相互作用对制备低聚木糖效果影响显著，随着pH与酶解时间的增大，低聚木糖含量先增后减。由图8可以看出，加酶量与酶解温度相互作用对制备低聚木糖效果影响显著。随着加酶量与酶解温度的增大，低聚木糖含量先增后减。

图7 pH和酶解时间相互作用对制备低聚木糖效果的影响

图8 加酶量和酶解温度相互作用对制备低聚木糖效果的影响

由图9可以看出，加酶量与酶解时间相互作用对制备低聚木糖效果影响显著，随着加酶量与酶解时间的增大，低聚木糖含量先增后减。由图10可以看出，酶解温度与酶解时间相互作用对制备低聚木糖效果影响显著，随着酶解温度与酶解时间的增大，低聚木糖含量先增后减。

图9 加酶量和酶解时间相互作用对制备低聚木糖效果的影响

图10 酶解温度和酶解时间相互作用对制备低聚木糖效果的影响

由草石蚕酶法制备低聚木糖试验各因素曲面图可看出，响应值存在最大值。对草石蚕酶法制备低聚木糖的条件进行预测，得到草石蚕酶法制备低聚木糖的最佳条件为pH为4，加酶量为379 mol/kg，酶解温度为54℃，酶解时间为94 min。

2.2.3 验证试验依据表4进行验证试验，以验证试验得到的草石蚕酶法制备低聚木糖的最佳条件为可靠。从表4看出，优化组的低聚木糖含量最高，达到6.92 mg/mL，与3个对照组相比分别高了15.1%、11.4%、9.5%，且差异显著。因此草石蚕酶法制备低聚木糖的最佳条件为pH为4，加酶量为379 mol/kg，酶解温度为54℃，酶解时间为94 min。

表4 验证试验设计表

2.3 低聚木糖抗氧化性研究

2.3.1 羟自由基清除能力图11显示，低聚木糖对羟自由基的清除能力随着其浓度的增加而不断增强，低聚木糖浓度与羟自由基清除能力两者之间基本呈线性相关，当低聚木糖浓度为60 mg/mL时，羟自由基清除率为87.2%，由此可以看出，低聚木糖对羟自由基的清除能力较强。

图11 低聚木糖对羟自由基清除率的影响

2.3.2 超氧阴离子自由基清除能力图12显示，低聚木糖对超氧阴离子自由基的清除能力随着其浓度的增加而不断增强，低聚木糖浓度与超氧阴离子自由基清除能力两者之间基本呈线性相关，当低聚木糖浓度为60 mg/mL时，羟自由基清除率为89.6%，由此可以看出，低聚木糖对超氧阴离子自由基的清除能力较强。

3 结论

草石蚕酶法制备低聚木糖的最佳条件为pH为4，加酶量为379 mol/kg，酶解温度为54℃，酶解时间为94 min，此条件下低聚木糖含量达到6.92 mg/mL，与3个对照组相比分别高了15.1%、11.4%、9.5%，且差异显著。同时试验结果表明，低聚木糖具有很强的抗氧化能力，但草石蚕中的低聚木糖结构尚不确定，需要进一步验证和研究。

图12 低聚木糖对超氧阴离子自由基清除率的影响

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3.3 指标的表观回肠消化率和能量含量不同原料之间GE和DM的AID和ATTD有差异（P＜0.05）（表4）。DDC和CGnM中大部分干物质分别为淀粉和蛋白质，因此在所有原料中GE和DM的AID最大（P＜0.05）。4种DDGS原料和玉米皮中GE和DM的AID相似（P＞0.05）。

正如预期，DDC和CGnM中GE的ATTD最大（P＜0.05），分别是99.6%和91.6%。相比之下，CB-S和CB中GE和DM的ATTD最低，但两个原料的AID值相似，说明两种原料均高度耐后肠发酵。DDGS，CGMM和CGnM中GE和DM的ATTD都与以前报道的结果一致（Rojas和Stein，

This test mainly studied the the preparation of xylo-oligosaccharide from Chinese artichoke and its antioxidant activity.The optimum condition of preparation of xylo-oligosaccharide from Chinese artichoke using enzymatic methods by response surface method were obtained，pH for 4，enzyme concentration for 379 mol/kg，enzymolysis temperature for 54℃，enzymolysis time for 94 min，and xylo-oligosaccharide content was 6.92 mg/mL at this condition，which was increased by 15.1%，15.1%，9.5%compared with the 3 control groups.And the experimental results showed that xylooligosaccharide had strong ability of scavenging hydroxyl free radical and superoxide anion free radical，so xylo-oligosaccharide had strong antioxidant activity.

Chinese artichoke；xylo-oligosaccharide；antioxidant activity