大孔树脂纯化杠板归总黄酮的工艺研究

毛磊　王琦燕　陶锋

摘 要：目的：研究大孔树脂纯化杠板归总黄酮的最佳工艺参数条件。方法：用紫外分光光度法测定，以杠板归总黄酮的吸附率和解吸附率为考察指标，考察杠板归总黄酮在3种不同类型大孔吸附树脂（D101，AB-8，NKA-9）上的吸附和解吸附行为，通过动态吸附试验考察不同上样浓度、不同体积分数的乙醇、pH值对洗脱效果的影响等因素选择其工艺参数。结果：在实验条件下，最佳纯化工艺为在pH=6条件下，以AB-8型大孔树脂为吸附剂，体积分数为70%的乙醇为洗脱剂，上样浓度为21.34 mg·mL-1。结论；该方法简便易操作，纯化工艺的效果比较好。

关键词：杠板归；总黄酮；大孔树脂；纯化工艺

中图分类号：TS201.1 文献标识码：A 文章编号：1006-8937（2016）14-0165-02

1 概 述

杠板归是蓼科蓼属植物杠板归Polygonum perfoliatum L.的干燥地上部分[1]，又名贯叶蓼、蛇不过、河白草、梨头刺、蛇倒退等[2]，具有清热解毒、利水消肿、散瘀止血、止咳祛痰、抗氧化、抗炎抗菌、抗肿瘤、护肝、降血压等功效[3]。有研究报道杠板归中的主要成分是槲皮素为主的黄酮类化合物[4]，黄酮类化合物能预防和治疗老年人的高血压和脑溢血，且有治疗冠心病和心绞痛的作用[5]，药用价值高。有效分离纯化杠板归中的黄酮类物质，对开发和利用杠板归的资源有比较重大的意义。

本论文应用大孔树脂进行纯化工艺的研究，对杠板归中的总黄酮进行纯化，应用静态吸附-解吸附试验在3种不同类型的大孔树脂中进行筛选，优选出最佳的大孔树脂的型号—AB-8型，并采用动态吸附试验选择AB-8型大孔吸附树脂的适宜工艺条件，为其相关大生产应用提供理论的参数和依据。

2 材料和仪器

2.1 材 料

杠板归（浙江中医药大学第二门诊部提供，经浙江医学高等专科学校陶锋副教授鉴定为蓼科植物杠板归的干燥地上部分），AB-8，D101，NKA-9型大孔树脂，其余试剂均为分析纯。

2.2 仪 器

Sartorius BP 110S电子天平（德国）紫外分光光度计。

3 方法与结果

3.1 标准曲线

精密准确地称取芦丁对照品20 mg，放置在100 mL的容量瓶中，加适量60%的乙醇溶解后，振荡，定容，即获得芦丁的标准对照液（200μg/mL）。依次精密移取0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL芦丁对照液于25 ml的容量瓶中，补充60%的乙醇达6ml，再依次精密加入5%亚硝酸钠溶液0.75 ml，摇匀后放置6 min；再精密加入10%硝酸铝溶液0.75 ml，摇匀后放置6 min；精密加入10 mL4%氢氧化钠溶液10 ml，以60%的乙醇定容，摇匀；静置15 min后，以第1瓶为空白调零，测定各瓶溶液的吸光度的值。并以芦丁的浓度C为x，测得吸光度A为y，得到以下回归方程：

A=7.5958C+0.0280，r2=0.9997

表明芦丁在8.2 ～57.4 μg/mL的范围内其线性关系较良好。

3.2 大孔树脂筛选

3.2.1 大孔树脂的预处理

取3种类型的树脂适量，用95%的乙醇将其浸润24 h，使其充分溶解膨胀，倒出乙醇和杂物后湿法装柱，用95%的乙醇反复冲洗，不定时的检查其流出的液体，至其与水混合后不出现白色浑浊为止。接着用大量的蒸馏水反复冲洗，直到没有醇味，待用。

3.2.2 粗提液的制备

将杠板归粉碎至粗粉，并用60%的乙醇25倍量，于70 ℃萃取5 min，取滤液；相同的方法再重复操作一次，两次提取液放一起，回收乙醇，得到浓缩至42.67 mg·mL-1的杠板归粗提液。

3.2.3 样品的含量测定

用移液管精确移取样品1.0 mL，放置在10 mL的容量瓶中，用纯化水定容；精确移取对照品1.0 mL，放置在10 mL的容量瓶中，用纯化水定容，于500 nm波长下测定其吸光度，以对照品计算其黄酮的含量。

3.2.4 静态吸附与解吸附

精密称取1.00 g D101、AB-8、NKA-9三种型号的树脂在 50 mL的具塞锥形瓶中，加入10.67 mg·mL-1浓缩液10 ml置于摇床中，在30 ℃的条件下震摇24h，过滤，得滤液1，测定其黄酮浓度（C1）。

取出饱和的树脂，在树脂中加入50%乙醇10 mL，相同情况下震摇24 h，再过滤，得滤液2，测定其总黄酮的浓度（C2）。

吸附率=（C0-C1）×100%/C0（1）

吸附量=（C0-C1）×V/C0 （2）

解吸率=C2×100%/（C0-C1） （3）

式中：C0为原液的浓度（mg·mL-1）；

C1为吸附后剩余溶液的浓度（mg·mL-1）；

C2为洗脱液浓度（mg·mL-1）；

V为洗脱液体积（mL），结果见表1。

结果表明：采用AB-8型号的吸附率和解吸附率最好，纯化效果最强。

3.3 AB-8树脂的纯化工艺条件优选

3.3.1 上样浓度的选择

精确称量已经预处理的湿树脂10 g，湿法装入层析柱中。将3种不同浓度的样品液10.67，21.34，32.01 mg·mL-1分别依次上柱，进行动态吸附试验，接取流出液，水洗至无色后，用50%的乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩干燥后成固体，计算其中总黄酮的含量，结果，见表2。

结果表明：总体考量总黄酮的洗脱率和其纯净度，总结得21.34 mg·mL-1为上样液的浓度。

3.3.2 不同体积分数乙醇的选择

精密称取6份各3 g（湿重）AB-8型树脂，湿法装柱，精密移取10.67 mg·mL-1浓缩液各5 mL，分别装柱，以纯化水洗至流出液无色后，分别用30%，50%，60%，70%，80%，95%不同体积分数的乙醇进行动态洗脱到洗脱液无色，收集洗脱液。测定收集到的洗脱液的总黄酮的浓度，计算洗脱液的洗脱百分率，并将洗脱液干燥成固体，测定其总黄酮含量，结果，见表3。

结果表明：总体考量总洗脱率和产物纯度，确定70%体积分数的乙醇对树脂洗脱的效果最佳。

3.3.3 PH的选择

精确称量经预处理的AB-8湿树脂10克，湿量法装柱，用稀盐酸调节其pH值分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0。对各pH值下的树脂的洗脱率进行了比较，并分别测定其中的黄酮的固体产物纯度，结果，见表4。

结果表明：总体考量其洗脱率和产物的浓度，总结得出pH=6为最好的酸碱度。

3.4 漏曲线与洗脱曲线考察

按上述条件上样并用大量水冲洗，以每10mL为1份收集此过程的流出液，测定杠板归总黄酮的含量，以y为累积的渗出浓度，x为体积作图，绘制渗漏曲线，如图1所示。

4 讨 论

通过比较3种不同极性的大孔树脂（D101是非极性，AB-8是弱极性，NKA-9是极性），发现弱极性AB-8型的大孔吸附树脂对杠板归总黄酮的纯化效果最好，富集能力比较强。用50%的乙醇洗脱，洗脱率达到71.1%，综合性能好，适用于杠板归总黄酮的纯化。

经过对纯化工艺参数进行考察，验证了中草药杠板归中总黄酮的适宜工艺为：上样体积是10 mL，上样液的浓度为 21.34 mg·mL-1，洗脱率达到67.34%，其纯度达到74.03%；70%体积分数的乙醇为洗脱浓度，洗脱率随着乙醇体积分数的增加而提高，产物的纯度在70%的乙醇体积分数下达到峰值74.76%；确定pH=6为最佳pH值，洗脱率虽然在pH=5相对较高，但综合考虑产物的纯度，得出pH=6时的纯度较高，为62.14%，由此可见弱酸性或偏中性比较适合洗脱。该纯化工艺操作简易，可重复利用，可以作为杠板归总黄酮的有效纯化方法，能得到理想的纯度，为进一步利用开发中草药杠板归提供了研究基础。

参考文献：

[1] 高雅，李豪，钟明利，等.杠板归总黄酮抗肝纤维化大鼠的作用及其机制 研究[J].华西药学杂志，2015，（2）..

[2] 陶锋，张如松.杠板归的体内外抗肿瘤作用实验研究[J].中华中医药学 刊，2013，（9）.

[3] 中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国药典：1部[M]北京：人民卫生出版社，2010.

[4] 成焕波，刘新桥，陈科力.杠板归化学成分及药理作用研究概况[J].中国现代中药，2012，（3）.

[5] Weng X Y，Zhao L L，Zheng C J，Zhu J W. Characteristics of the hyperaccumulator plant Phytolacca acinosa （ Phytolaccaceae）in response to excess manganese. Journal of Plant Nutrition，2013，（9）