胶质瘤靶向MGMT增敏替莫唑胺治疗

江浩然 荆国杰

[摘要] 替莫唑胺（Temozolomide，TMZ）作为一种新型烷化剂药物对各种实体性肿瘤有着明显的抗肿瘤作用，其中在胶质瘤的治疗中，其作为一线用药更是有着不可取代的地位。替莫唑胺能够对基因组DNA造成损伤，从而杀伤肿瘤细胞，但是这种损伤能被O6-甲基鸟嘌呤-DNA 甲基转移酶（O6-methylguanine DNA methyltranferase，MGMT）所修复，从而造成化疗耐药，直接影响替莫唑胺的杀伤肿瘤的作用。本综述主要叙述了近期在本领域中最新的针对MGMT增敏替莫唑胺的研究。

[关键词] 胶质瘤；MGMT；TMZ；增敏

[中图分类号] R739.4 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2016）06-0165-04

Strategies to improve the sensibility of temozolomide in glioma treatment：Targeting the protein MGMT

JIANG Haoran JING Guojie

Department of Neurosurgery， the First People's Hospital of Huizhou City， Affiliated to Guangdong Medical College，Huizhou 516003，China

[Abstract] Alkylating agents such as temozolomide（TMZ）are effective anticancer drugs for treating a variety of solid tumors. What's more，it has an irreplaceable position in glioma treatment as a first-line drugs.TMZ exerts its effects mainly via a cytotoxic DNA lesion. Unfortunately，this damage may be repaired by the DNA repair enzyme O6-methylguanine DNA methyltransferase（MGMT）， a key player in the resistance of cancers to TMZ. In this review， we provide an overview of recent advances about improving the killing of tumor cells by TMZ， with inhibition of MGMT being the most promising.

[Key words] Glioma； MGMT； TMZ； Sensibilization

脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发恶性肿瘤，约占所有原发颅内肿瘤的33.7%，主要治疗方式是以手术、放疗和化疗为主的综合治疗。但其预后并不如想象的乐观，特别是在恶性脑胶质瘤中、其对于常规放疗及化疗有高度抵抗性，即便术后行TMZ同期放化疗，胶质母细胞瘤患者的中位生存期也仅由12.1个月提高到14.6个月，5年生存率仅为9.8%[1]。除自身生物学特性及血脑屏障的原因以外，导致恶性脑胶质瘤治疗瓶颈的重要原因之一就是化疗耐药，所以增强化疗药物在治疗脑胶质瘤的作用是一个迫在眉睫的问题。

在替莫唑胺上市之前的几十年间，亚硝脲类药物已经作为治疗恶性胶质瘤的一线药物广泛应用，然而由于其骨髓抑制等毒性较为严重，加之疗效不明显，化疗在胶质瘤治疗中的地位一直没有得到重视。替莫唑胺作为新一代抗肿瘤药物，它的口服生物利用率接近100%，并且能透过血脑屏障，渗透至包括大脑的人体各个组织[2，3]。能够有效延长恶性胶质瘤患者的中位无进展生存时间（progression free survival，PFS）及总生存时间（overall survival，OS）[4]，但是与人类其他恶性肿瘤的化疗效果相比，在胶质瘤化疗方面所取得的进展仍不尽人意，目前研究表明，胶质瘤细胞对化疗药物的抵抗作用的分子机制非常复杂，其中MGMT作为一种DNA损伤修复蛋白，是当今研究的热点[5]。为了有效改善TMZ的抗肿瘤作用，很多针对MGMT的方案不断地被提出，包括伪底物疗法、基因疗法、抗癫痫药物疗法和病毒疗法等。

1 MGMT在替莫唑胺治疗胶质瘤中的角色

TMZ是一种烷化剂药物，主要通过在DNA水平O6鸟嘌呤的位置添加一个甲基基团导致胸腺嘧啶与O6甲基鸟嘌呤（O6-meG）的结合替代了原来的胞嘧啶残基，从而导致DNA复制停滞，诱导细胞凋亡[6]。而MGMT作为一种DNA损伤修复蛋白，是TMZ化疗耐药关键的因素，科学家们多年来对此做了很多的研究，发现糖皮质激素、AMP、蛋白酶C和DNA的损伤都会促进转录因子特异性蛋白1，激活蛋白1，2与MGMT启动子的结合，使其表达增加[7]。研究表明，MGMT的过表达以及启动子甲基化使肿瘤细胞更有效抵抗TMZ药物的毒性，这表明MGMT与肿瘤药物化疗抵抗有密切的关系，并且与患者预后有直接的关系[8]。MGMT可以通过去除甲基化基团来修复由TMZ造成的DNA损伤，但是一分子MGMT只能修复一个DNA损伤，所以当过量的DNA损伤出现，MGMT就会完全耗尽[9]。O6-meG 残基如果不能被修复，将会引起O6-meG：C在DNA复制后转换突变成了O6-meG：T[10]。错配修复系统复合体MutSα and MutLα对O6-meG：T这样的错配马上便能发现，且其对它有很强的亲和力[11]，迅速激活整个错配修复系统，从而导致细胞分裂合成期及其后的细胞分裂的第二间隙期的停滞不前[12]。MGMT介导的修复功能在DNA修复通路中是单一的，首先、其并没有与其他蛋白或者细胞因子共同发挥作用；其二、将烷基基团转移到蛋白质内部的胞嘧啶残基，即作为烷基基团的转运体和受体，当从鸟嘌呤那里接收到烷基，马上失活，所以，是一个自杀性蛋白[13]。总的来说，通过调节MGMT的表达能够有效改善烷基化药物的化疗作用。

2 针对MGMT增敏TMZ的治疗方案

2.1 MGMT伪底物联合TMZ

O6苄基（O6-benzylguanine，O6-BG）是应用广泛的MGMT抑制剂，它有效使MGMT失活，增强TMZ在治疗人脑胶质瘤中的抑制肿瘤生长作用[14]。Koch等发现，术中切除脑肿瘤后辅以颅内局部使用O6-BG联合TMZ规范化治疗，与复发胶质母细胞瘤的患者短暂的肿瘤稳态有明显关系，且并没有明显的副作用[15]。随后在很多不同肿瘤的领域，如脑肿瘤、黑色素瘤、淋巴瘤、结肠癌和结肠，O6-BG 联合TMZ的一期及二期临床试验不断完成，后面二期和三期的临床试验不断地进行[16，17]。喜人的是，Quinn等[18]随后进行二期临床研究，发现O6-BG联合TMZ确实能延长患者的生存时间。预示着O6-BG在脑胶质瘤治疗中是一个很有前景的治疗策略。

2.2 抗癫痫药物联合TMZ

癫痫是脑胶质瘤患者常见的伴随症状，抗癫痫药物在胶质瘤患者中使用频率非常高，而丙戊酸钠与左乙拉西坦都是临床上使用非常广泛的抗癫痫药物。①丙戊酸钠在体外实验中发现，联合TMZ能显著增强TMZ对细胞增殖抑制的作用，且明显降低MGMT的表达[19]。丙戊酸钠在动物实验中联合TMZ效果依然显著，Hosein等[20]在裸鼠实验中发现丙戊酸钠联合TMZ能明显延长裸鼠的生存期，同时Krauze[21]在临床试验中，同样发现该方案也能显著延长患者的PFS及OS。②左乙拉西坦是抗癫痫药物中最有效的MGMT抑制剂，具有多种MGMT调节作用。在体外实验中，治疗癫痫剂量范围的能下调MGMT蛋白的量和其mRNA的表达，有效增敏TMZ。其机制主要通过上调突变型P53，P53就是一个通过激活多种基因来治疗胶质瘤的转录因子，它可以抑制细胞增殖，诱导凋亡和衰老，在DNA损伤应答及修复过程中发挥很大的作用[22，23]。所以MGMT很有可能是由P53调节的，且P53的上调能抑制MGMT转录。最近有临床试验证实，左乙拉西坦联合TMZ治疗胶质母细胞瘤患者中，能显著延长PFS及OS，这一结果或许会使左乙拉西坦联合TMZ这一治疗方案在临床中广泛应用[24]。

2.3 基因疗法联合TMZ

目前基因治疗模式大多专注于肿瘤抑制基因和抗肿瘤免疫反应的调节。①β-干扰素（IFN-β）属于一型干扰素，它表现出各种各样的生物学作用，包括免疫调节作用、抗血管生成作用和直接的抗肿瘤作用。研究[25，26]发现IFN-β联合TMZ在胶质母细胞系及其干细胞样细胞系中可以下调MGMT表达来提高TMZ对胶质瘤细胞的抑制作用，随后的临床试验中发现该治疗方案有效延长OS，且得到核磁共振（MRI）图像的支持[27]。②RNA干扰在人类肿瘤治疗中被赋予很高的评价，它能够有效下调目的基因的表达，达到抗肿瘤的目的。在体外实验中，Kato[28]用MGMT靶性siRNA处理细胞，再用TMZ规范化治疗，使TMZ耐药的细胞系重新焕发他们对TMZ的敏感性。然而，随后有科学家用MGMT-siRNA联合TMZ在大鼠与猪的颅内成瘤模型中，发现siRNA联合替莫唑胺在动物试验中并未表现增敏TMZ的作用[29]。

2.4 病毒疗法联合TMZ

最新的研究表明[30]，腺病毒和单纯疱疹病毒等溶瘤病毒已经作为一种新的治疗方法在临床使用，其中在胶质瘤治疗中也被重点研究。与其他化疗药物不同的是，溶瘤病毒并非造成胶质瘤细胞的DNA损伤，而是通过控制或失活DNA修复系统来发挥抗肿瘤作用。同时，溶瘤病毒在肿瘤细胞中有高度选择性，其联合TMZ对肿瘤也证实的杀伤作用远远大于正常细胞。另一方面，肿瘤细胞对TMZ的细胞应答可以延迟肿瘤体积的增大，这使病毒提早释放以致在肿瘤块中更快地复制[31]。溶瘤病毒△-24-RGD在研究中发现能沉默MGMT启动子，联合TMZ在胶质瘤细胞系产生更好的杀伤作用，在随后的裸鼠模型中，也证实能明显延长裸鼠的生存时间[32]。

2.5 其他

前期有很多研究发现，41℃～42℃的高温会直接导致肿瘤细胞死亡，有趣的是，这样温和的高温的确能够增加细胞毒性药物的药物作用[33，34]。最近有研究表明在黑色素瘤细胞系中，在一个预设的环境中，高温可以明显增强TMZ的抗肿瘤作用[35]。其机制很可能是经过TMZ处理过的细胞系在高温的环境下比在37℃的环境中所形成的O6-meG数量明显增加。事实上，当处理药物移去后，在41.5℃高温下，MGMT的复苏明显会延迟，导致MGMT修复DNA损伤的能力明显下降。以上的这些发现预示着，高温联合TMZ的治疗是一个非常有潜力的一个新方向。

3 结论

TMZ是一个对各种实体性肿瘤效果显著的化疗药物，但是肿瘤对其耐药性以不可预测的速度在发展，增敏替莫唑胺的研究迫在眉睫。TMZ化疗耐药其中一个重要机制就是MGMT的过表达，MGMT的高表达与化疗的效果呈明显的反比关系。很多改善TMZ抗肿瘤作用的研究不断被发现，如伪底物疗法、基因疗法、抗癫痫药物疗法和病毒疗法。但我们必须承认，尽管很多研究获得很大的成功，但是其研究进展大多停留在体外实验及动物实验中，能够到达临床试验的研究少之又少。在研究中发现，很多MGMT表达很低的细胞系依然对TMZ有明显的耐药作用，这表明还有更多的耐药机制我们并未发现，为阐明这些机制，我们仍需作更多的努力。

[参考文献]

[1] Stupp R，Mason WP，Van den Bent MJ，et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma[J]. N Engl J Med，2005，352（10）：987-996.

[2] Middlemas DS，Stewart CF，Kirstein MN，et al. Biochemical correlates of temozolomide sensitivity in pediatric solid tumor xenograft models[J]. Clin Cancer Res，2000，6（3）：998-1007.

[3] Plummer ER，Middleton MR，Jones C，et al. Temozolomide pharmacodynamics in patients with metastatic melanoma：DNA damage and activity of repair enzymes O6-alkylguanine alkyltransferase and poly（ADP-ribose） polymerase-1[J].Clin Cancer Res，2005，11（9）：3402-3409.

[4] Roos WP，Batista LF，Naumann SC，et al. Apoptosis in malignant glioma cells triggered by the temozolomide-induced DNA lesion O6-methylguanine[J]. Oncogene，2007， 26（2）：186-197.

[5] Johannessen TC，Bjerkvig R. Molecular mechanisms of temozolomide resistance in glioblastoma multiforme[J]. Expert Rev Anticancer Ther， 2012，12（5）：635-642.

[6] Roos WP，Batista LF，Naumann SC，et al. Apoptosis in malignant glioma cells triggered by the temozolomide-induced DNA lesion O6-methylguanine[J]. Oncogene，2007， 26（2）：186-197.

[7] Gerson SL. MGMT：Its role in cancer aetiology and cancer therapeutics[J]. Nat Rev Cancer，2004，4（4）：296-307.

[8] Cen L，Carlson BL，Pokorny JL，et al. Efficacy of protracted temozolomide dosing is limited in MGMT unmethylated GBM xenograft models[J]. Neuro Oncol，2013，15（6）：735-746.

[9] Sharma S，Salehi F，Scheithauer BW，et al. Role of MGMT in tumor development，progression，diagnosis，treatment and prognosis[J]. Anticancer Res，2009，29（10）：3759-3768.

[10] Karran P，Bignami M. Self-destruction and tolerance in resistance of mammalian cells to alkylation damage[J]. Nucleic Acids Res，1992，20（12）：2933-2940.

[11] Stojic L，Brun R，Jiricny J. Mismatch repair and DNA damage signalling[J]. DNA Repair（Amst），2004，3（8-9）：1091-1101.

[12] Yoshioka K，Yoshioka Y，Hsieh P. ATR kinase activation mediated by MutSalpha and MutLalpha in response to cytotoxic O6-methylguanine adducts[J]. Mol Cell，2006， 22（4）：501-510.

[13] Hegi ME，Liu L，Herman JG，et al. Correlation of O6-methylguanine methyltransferase（MGMT） promoter me-thylation with clinical outcomes in glioblastoma and clinical strategies to modulate MGMT activity[J]. J Clin Oncol，2008，26（25）：4189-4199.

[14] Lai IC，Shih PH，Yao CJ，et al. Elimination of cancer stem-like cells and potentiation of temozolomide sensitivity by Honokiol in glioblastoma multiforme cells[J]. PLoS One，2015，12（3）：e0114830.

[15] Koch D，Hundsberger T，Boor S，et al. Local intracerebral administration of O（6）-benzylguanine combined with systemic chemotherapy with temozolomide of a patient suffering from a recurrent glioblastoma[J]. J Neurooncol，2007，82（1）：85-89.

[16] Quinn JA，Jiang SX，Reardon DA，et al. Phase I trial of temozolomide plus O6-benzylguanine 5-day regimen with recurrent malignant glioma[J]. Neuro Oncol，2009，11（5）：556-561.

[17] Verbeek B，Southgate TD，Gilham DE，et al. O6-Methylguanine DNA methyltransferase inactivation and che-motherapy[J]. Br Med Bull，2008，85：17-33.

[18] Quinn JA，Jiang SX，Carter J，et al. Phase II trial of Gliadel plus O6-benzylguanine in adults with recurrent glioblastoma multiforme[J]. Clin Cancer Res，2009，15（3）：1064-1068.

[19] Ryu CH，Yoon WS，Park KY，et al. Valproic acid downregulates the expression of MGMT and sensitizes temozolomide-resistant glioma cells[J]. J Biomed Biotechnol，2012，2012：987495.

[20] Hosein AN，Lim YC，Day B，et al. The effect of valproic acid in combination with irradiation and temozolomide on primary human glioblastoma cells[J]. J Neurooncol，2015， 122（2）：263-271.

[21] Krauze AV，Myrehaug SD，Chang MG，et al. A phase 2 study of concurrent radiation therapy，Temozolomide，and the histone deacetylase inhibitor valproic acid for patients with glioblastoma[J]. Int J Radiat Oncol Biol Phys，2015，92（5）：986-992.

[22] Bobustuc GC，Baker CH，Limaye A，et al. Levetiracetam enhances p53-mediated MGMT inhibition and sensitizes glioblastoma cells to temozolomide[J]. Neuro Oncol，2010， 12（9）：917-927.

[23] Marchetti A，Cecchinelli B，D'Angelo M，et al. p53 can inhibit cell proliferation through caspase-mediated cleavage of ERK2/MAPK[J]. Cell Death Differ，2004，11（6）：596-607.

[24] Kim YH，Kim T，Joo JD，et al. Survival benefit of levetiracetam in patients treated with concomitant chemoradiotherapy and adjuvant chemotherapy with temozolomide for glioblastoma multiforme[J]. Cancer，2015，121（17）：2926-2932.

[25] Yoshino A，Ogino A，Yachi K，et al. Effect of IFN-beta on human glioma cell lines with temozolomide resistance[J].Int J Oncol，2009，35（1）：139-148.

[26] Shen D，Guo CC，Wang J，et al. Interferon-alpha/beta enhances temozolomide activity against MGMT-positive glioma stem-like cells[J]. Oncol Rep，2015，34（5）：2715-2721.

[27] Kawaji H，Tokuyama T，Yamasaki T，et al. Interferon-beta and temozolomide combination therapy for temozolomide monotherapy-refractory malignant gliomas[J]. Mol Clin Oncol，2015，3（4）：909-913.

[28] Kato T，Natsume A，Toda H.，et al. Efficient delivery of liposome-mediated MGMT-siRNA reinforces the cytotoxity of temozoomide in GBM-initiating cells[J]. Gene Ther，2010， 17（11）：1363-1371.

[29] Tsujiuchi T，Natsume A，Motomura K，et al. Preclinical evaluation of and O（6）-methylguanine-DNA methyltransferase-siRNA/liposome complex administered by convection-enhanced delivery to rat and porcine brains[J].Am J Transl Res，2014，6（2）：169-178.

[30] Gomez-Manzano C，Fueyo J. Oncolytic adenoviruses for the treatment of brain tumors[J]. Curr Opin Mol Ther，2010，12（5）：530-537.

[31] Aghi M，Rabkin S，Martuza RL. Effect of chemotherapy-induced DNA repair on oncolytic herpes simplex viral replication[J]. J Natl Cancer Inst，2006，98（1）：38-50.

[32] Alonso MM，Gomez-Manzano C，Bekele BN，et al. Adenovirus-based strategies overcome temozolomide resistance by silencing the O6-methylguanine-DNA methyltransferase promoter[J]. Cancer Res，2007，67（24）：11499-11504.

[33] Wust P，Hildebrandt B，Sreenivasa G，et al. Hyperthermia in combined treatment of cancer[J]. Lancet Oncol，2002， 3（8）：487-497.

[34] Hildebrandt B，Wust P，Ahlers O，et al. The cellular and molecular basis of hyperthermia[J]. Crit Rev Oncol Hematol，2002，43（1）：33-56.

[35] Pagani E，Falcinelli S，Pepponi R，et al. Combined effect of temozolomide and hyperthermia on human melanoma cell growth and O6-methylguanine-DNA methyltransferase activity[J]. Int J Oncol，2007，30（2）：443-451.

（收稿日期：2015-12-07）