青岛地区鹅掌柴炭疽病病原菌鉴定

迟梦宇 钱恒伟 赵颖 黄金光

摘要：2015年鹅掌柴炭疽病在青岛地区发病严重，发病率达50%。本研究从青岛城阳区采集鹅掌柴炭疽病病叶，采用组织分离法对病原菌进行分离，结合形态学观察与分子生物学方法对其进行鉴定。结果表明，引起青岛地区鹅掌柴炭疽病的病原菌是胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides （Penz.）Sacc.）。此病原菌引起的鹅掌柴炭疽病在山东省是首次报道。

关键词：鹅掌柴炭疽病菌；胶孢炭疽菌；形态特征；分子鉴定

中图分类号：S436.8+1文献标识号：A文章编号：1001-4942（2016）06-0092-03

鹅掌柴（Schefflera actinophylla [Endl.] Harms）俗名大叶伞，隶属五加科，鹅掌柴属，是一种深受人们喜爱的常绿观叶木本花卉植物，可用于花园、花坛、道路绿化或者作为盆栽置于庭院和室内观赏。鹅掌柴原产于大洋洲、我国广东、福建等亚热带雨林，日本、越南、印度也有分布，现广泛种植于世界各地。但是，鹅掌柴在繁殖和栽培种植时常会发生病害，大大影响其观赏价值。对鹅掌柴的病原真菌，美国记载了15种[1]。在我国，2003年，习平根等[2]调查鉴定了广东省鹅掌柴12种真菌病害及其病原菌，其中以叶疫病和炭疽病危害较重。2012年，黄江华等[3]对广东省鹅掌柴炭疽病病原菌进行鉴定。2015年，鹅掌柴炭疽病在青岛地区发病严重，发病率高达50%。为有效防控鹅掌柴炭疽病，笔者用病原形态学及分子生物学方法研究青岛市鹅掌柴炭疽病病原菌，为该病的综合治理提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料与试剂

1.1.1供试材料2015年11月采集青岛城阳地区的鹅掌柴炭疽病病叶，并对其进行分离纯化。

1.1.2试剂马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g、蒸馏水1 000 mL；75%乙醇（化学纯）；0.1%升汞溶液；无菌水。

1.2试验方法

1.2.1病原菌的分离纯化与培养采用组织分离法对鹅掌柴病叶上的病原菌进行分离。于病健交界处切取病组织长度为4～5 mm的小块，置于75%乙醇中浸泡5 s，接着移入0.1%升汞溶液中浸泡3～5 min，无菌水漂洗3遍，最后将病组织移到PDA培养基上，置于25℃培养箱中培养3～7 d[4]。

从边缘挑取病原菌菌丝于PDA培养基上，25℃培养箱中进行纯培养，4 d后挑取纯培养菌丝至斜面保存。

1.2.2致病性接种及再分离挑取3片健康鹅掌柴叶片，用无菌水清洗叶片表面并用酒精消毒。用灭菌针将叶片刺伤，再接种病原菌块，将接好菌的叶片放在盛有湿润滤纸的培养皿中，25℃培养7 d后观察发病情况，以无菌PDA接种作为阴性对照。从接种的发病组织上再次分离纯化病原菌。

1.2.3病原菌形态观察用1 mL无菌水反复冲洗PDA上的分生孢子以获得浓度为104个/mL的孢子悬浮液，用灭菌接种针挑取少量菌丝置于灭菌载玻片上，用挑针挑取培养基内部的菌核放在滴有无菌水的载玻片上，在Olympus BX53显微镜下观察病原菌的菌核、菌丝、分生孢子梗和分生孢子特征并拍摄形态图，测量分生孢子大小。

1.2.4病原菌rDNA-ITS序列测定采用CTAB法提取病原菌基因组DNA[5]，用真菌通用引物ITS1和ITS4进行PCR扩增[6]（ITS1： 5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′；ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）。PCR反应体系为25 μL，反应液为：10×Buffer 2.5 μL，dNTP 1 μL，引物（ITS1和ITS4）各1 μL，Taq酶0.5 μL，DNA模板3 μL，ddH2O 16 μL。PCR扩增程序：94℃预变性 5 min ；94℃变性45 s，53℃退火45 s，72℃延伸1 min，进行30个循环；72℃总延伸 10 min。在质量浓度为1%的琼脂糖凝胶上检测PCR结果，产物送生工生物工程（上海）股份有限公司测序，并进行BLAST同源性对比。

2结果与分析

2.1鹅掌柴炭疽病症状

发病初期，病斑从枝干中间向上向下发展，沿着叶脉侵染叶片，病斑近椭圆形，灰白色，形状规则至不规则形。在环境阴湿的情况下病斑不断扩展成水泽状墨绿色病块，发病严重的植株整条枝干和叶片均成墨绿色，枝干横切后内部也都变成墨绿色至黑褐色。后期病斑上可见黑色小点，为病原菌的分生孢子盘，湿度大时病部可产生大量的粉红色粘孢团（图1）。

2.2病原菌形态观察

在PDA培养基上，鹅掌柴炭疽病病原菌菌落白色至灰白色，边缘整齐，气生菌丝发达，后期产生菌核可长至培养基内。病原菌分生孢子梗无色，具隔膜；分生孢子无色，单孢，长椭圆形至圆柱形，较直，大小为（13.3～18.4） μm×（3.8～5.6）μm（图2）。根据形态结果初步判定病原菌为胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）。

2.3rDNA-ITS序列分析

应用真菌18S～28S rDNA间隔区序列的通用引物ITS1和ITS4，从病原菌基因组DNA中PCR扩增到一条约500 bp的片段（图3）。测序结果表明，该片段长547 bp（登录号：KU820630），将其在GenBank中进行同源比较分析，BLAST比对结果表明，该菌株的rDNA-ITS序列与已报道的C. gloeosporioides菌株（KT582155、KT582183）的序列相似性为99%。分子鉴定进一步证实该病原菌为Colletotrichum gloeosporioides。

3讨论与结论

鹅掌柴炭疽病是危害鹅掌柴的主要病害之一，在美国、中国广东省都有过报道。近年来，随着国内外花卉贸易的发展，青岛市从广东、云南等省市引种大量鹅掌柴。鹅掌柴炭疽病在青岛地区发病也日渐严重，影响了鹅掌柴的观赏价值，严重的引起植株死亡，造成较大经济损失。为有效防控鹅掌柴炭疽病，本研究对其病原菌进行了形态学和分子生物学鉴定，证实青岛鹅掌柴炭疽病病原菌为胶孢炭疽菌（C. gloeosporioides），对该地区鹅掌柴炭疽病的防治具有重要意义。该病原菌是炭疽属内最大的一个种群，其分布非常广泛，在海南、台湾、广东、广西、湖北、福建、山东等地均有分布，危害寄主近300种，可引起芒果、香蕉、葡萄、龙眼、万年青、七叶树等多种植物的炭疽病。炭疽病菌在潮湿环境下发病重，所以在福建、广东、海南等地区鹅掌柴炭疽病发病较重。

参考文献：

[1]Farr D F， Bills G F， Chamuris G P， et al. Fungi on plants and plant products in the United States[M]. Minnesota： APS Press， 1989：44.

[2]习平根，戚佩坤，姜子德. 鹅掌柴真菌病害鉴定[J]. 植物病理学报， 2003， 33（1）： 19-24.

[3]黄江华，叶宜丽. 鹅掌柴炭疽病病原菌鉴定[J]. 广东农业科学，2012（16）： 69.

[4]代丽婷，刘东，张艳菊.黑龙江省冬小麦雪腐病病原鉴定及生物学特性研究[J].植物保护，2013，39（1）：44-49.

[5]刘少华，陆金萍，朱瑞良，等.一种快速简便的植物病原真菌基因组DNA提取方法[J].植物病理学报，2005，35（4）：362-365.

[6]郭鹏豪，刘秀丽，崔颖鹏，等.真菌通用引物Its1和Its4在丝状真菌鉴定中的价值评价[J].中国微生态学杂志， 2013，25（8）：922-924.