正交试验法优化喜树叶中喜树碱的提取工艺

马云超　马珊珊　徐珊珊　丁孝营　宋冰

传统上喜树碱提取多采用70～90%乙醇渗漉，耗时长，操作繁琐。另有文献报道超声波和超临界流体等现代技术提取喜树碱，与常规溶剂提取法相比，其提取效率高，操作简便，但一次性投入成本高。本研究以甲醇为提取溶剂，利用正交实验法优化了喜树碱回流法提取工艺。

仪器与材料

高效液相色谱系统：LC-6A，日本岛津公司；电子分析天平：AUY220型，日本岛津公司；恒温水浴锅：DK-S14型，上海森信实验仪器有限公司；电热恒温干燥箱：DGG-9240B型，上海森信实验仪器有限公司；旋转蒸发仪：RE-52AA型，上海亚荣生化仪器厂。

所用甲醇为分析纯；蒸馏水及超纯水为实验室自制；喜树碱标准品纯度为95.8%；喜树叶样品采自浙江桐庐浙江林学院培植基地四年生喜树，叶子用自来水洗净，室温下阴干，粉碎后保存于干燥器中。

实验方法

喜树碱含量的HPLC分析方法。色谱条件：色谱柱SinoChrom ODS-BP（4.6mm×250mm，ID 5um）：检测波长254nm；流动相为乙腈/水（40：60，v/v）。

准确称取喜树叶干粉20g，置于500mL圆底烧瓶中，在设计条件下进行提取，提取液经铺有硅藻土的布氏漏斗抽滤，合并滤液，37℃旋转蒸发浓缩除去甲醇，用氯仿+5%甲醇等体积萃取浓缩液3次，浓缩回收氯仿，加入甲醇/氯仿（1/1，v/v）溶解浓缩物，定容]00m L，HPLC测定提取液中喜树碱的浓度。线性回归方程：Y=19656X+607.15，r=0.9986，线性范围：3.55～71μg·mL^-1。

喜树叶回流法提取工正交实验。在单因素实验基础上，选择甲醇浓度、提取时间、提取温度、料液比为考察因素，以喜树碱的提取率为考察指标，利用SPSS统计软件建立L₁₆（45）正交试验表（见表]）并进行方差分析。

结果与分析

正交结果与方差分析

正交实验结果及方差分析见表2及表3。

比较表2的R_（极差），各因素极差大小为：R_A>R_D>R_B>R_C，优先顺序为A>D>B>C，最优工艺为：A₁B₂C₄D₃，即甲醇浓度为65%，提取时间1h，料液比为1：16，提取温度为70℃。

从节约成本及环保角度考虑，优化工艺条件为：A₁B₂C₂D₃，即甲醇浓度为65%，提取时间1h，料液比為1：10，提取温度为70℃。在该工艺条件下平行提取5次，喜树碱提取率为0.490±0.004‰，结果表明优化条件下工艺稳定性较好。

该研究利用正交实验法进行多因素分析，优化了喜树碱的甲醇回流法提取工艺，明确了最佳工艺条件：甲醇浓度为65%，提取时间1h，料液比为1：10，提取温度为70℃，该工艺条件下，喜树碱的提取方法简便、提取率稳定，为喜树碱的进一步研究提供依据。