M—FASTTM（磁在快）沙门氏菌测试盒在沙门氏菌检验中的应用研究

陶文靖 曲连海 贾晨 刘磊 高琦 小池 尹艳 王文博

摘 要：据美国农业部农业经济研究部门最新数据统计显示，沙门氏菌每年在美国导致的医疗花费达到37亿美元，这个数据将沙门氏菌排在了美国食源性疾病花费最高的15大致病菌之首。另外，一系列沙门氏菌引起的食物中毒事件也表明，沙门氏菌早已成为全球最常见的食源性致病菌之一。传统沙门氏菌检测技术存在耗时、繁琐、低效等缺点，故快速、灵敏、可靠的新型快速检测技术成为研究热点。将免疫学和生物化学技术有机结合，利用微生物特异性免疫磁珠和微生物测试片实现待检致病菌的双重筛选，大大提高了沙门氏菌检测的特异性，灵敏度明显高于同类产品，并大幅度缩短检测时间。

关键词：沙门氏菌 食源性致病菌 免疫磁珠 测试片

世界范围内食品安全恶性事件接连发生，食品安全形势严峻，卫生部统计公告的食物中毒人数逐年递增，且食源性致病菌引起的占据首位[1]。据WHO估计，全世界每年的食源性疾病患者中，70%都是由致病性微生物所引起[2]。沙门氏菌主要污染肉及肉制品、蛋制品、奶制品等，鸡是沙门氏菌的天然宿主，感染了沙门氏菌的鸡肉制品是引起人沙门氏菌感染的主要途径。市场上的零售鸡肉，沙门氏菌阳性检出率高达50%。所以，开发快速、高效、准确的食源性致病菌快速检测方法已成为保障食品安全和防止疾病传染的关键。

1 沙门氏菌检测方法

国标规定，食品中沙门氏菌的检测主要是培养法和生理生化检测法，该检测法的特点是方法经典，但缺点是操作繁琐、试剂繁多、耗时较长，一个完整检测周期需要大约5～7天时间，远远不能够满足检测要求。目前，应用较多的快速检测法主要是即用培养法、免疫学法、分子生物学方法等。免疫学技术的优势是特异性高、耗时间短、结果可靠，适合批量检测和自动化检测；依赖于专业仪器分子学方法的优势是靶标明确、时间短、结果可靠，明显的不足则是引物和探针的选择及设计不当，可能降低灵敏度和特异性[3]；技术设备要求高，荧光探针价格昂贵，另外容易造成交叉污染是核酸法不能回避的问题等。

因此，设计和开发出特异性好、检测时间短、操作简便的沙门氏菌快速检测技术对于食品安全领域的微生物快速检测具有重要意义。

2 磁在快沙门氏菌测试盒原理

免疫磁性分离技术，又称为免疫磁珠法，可直接从样品或前增菌培养物中分离目的细菌。磁珠上包被能够特异识别目标细菌的抗体，通过抗原抗体反应从而形成一个磁珠和细菌的复合体，再通过磁场将磁珠收集使目标菌得到有效地富集和分离[4]，大大缩短前增菌时间。

微生物测试片是应用传统的微生物培养方法和现代生化鉴定技术相结合的检测技术。测试片的载体中含有可供目标生长的营养成分，选择剂以及特异酶显色底物，通过直接观察菌落颜色即可对细菌种类做出鉴定，是一种简单、方便、经济的检测方法。

磁在快检测试剂盒将两种检测方法结合，通过特异性免疫磁珠和微生物测试片对微生物进行双重筛选，提高了沙门氏菌检测的特异性。对于食品检测中的复杂样本，通过免疫磁珠的富集，能够有效去除干扰检测的杂质，并对样本具有浓缩作用，灵敏度明显高于同类产品，大幅度缩短增菌时间，整个检测过程在24h内可完成。同时，操作简单，不需要大型设备，可以节约空间、降低检测成本。

3 磁在快沙门氏菌测试盒验证方案

3.1 识别性和特异性

选取沙门氏菌标准菌株及分离株按照标准方法进行培养扩增，同时计数，稀释到测试所需浓度（100CFU/mL）。

磁在快测试方法为：取1mL分别加入到2mL的富集管中，放置37℃，150rpm/min震荡孵育15min，磁力富集，去上清，向菌株富集管中加入1mL清洗液，混匀磁力富集，向菌株富集管中加入1mL重悬缓冲液。使用移液管将菌株富集管中的混合物均匀滴加在沙门氏菌测试片上，37℃，培养18h。培养结束后，计数所有测试片上显示出蓝色的菌落。

对照方法为将1mL菌液直接涂布于LB平板中，37℃培养24h，计数所有生长菌落。

3.2 不同菌浓度的回收效率

选取鼠伤寒沙门氏菌（ATCC14028）按照标准方法进行培养扩增，同时计数，梯度稀释，每个稀释度取1mL，按照3.1所示方法进行测定。

3.3 不同体积的回收效率

选取鼠伤寒沙门氏菌（ATCC14028）按照标准方法进行培养扩增，同时计数，稀释到100CFU/mL，100 CFU/5mL，100 CFU/10mL，100CFU/25mL，按照3.1所示方法进行测定。

3.4 生鲜乳和猪肉中沙门氏菌的检测方法

生鲜乳样品20份，采自北京某奶厂，4℃进行保藏；猪肉样品20份，购于北京某批发市场。

生鲜乳：取样品25mL，加入磁珠，震荡15min，磁力富集，去上清，向菌株富集管中加入1mL清洗液，混匀磁力富集，向菌株富集管中加入1mL重悬缓冲液。使用移液管将菌株富集管中的混合物均匀滴加在沙门氏菌测试片上，37℃，培养18h。培养结束后，计数所有测试片上显示出蓝色的菌落。

猪肉：取样品25g，用20mLBPW均质，将均质液加入磁珠富集管中，37℃，震荡4h，磁力富集，去上清，向菌株富集管中加入1mL清洗液，混匀，磁力富集，向菌株富集管中加入1mL重悬缓冲液。使用移液管将菌株富集管中的混合物均匀滴加在沙门氏菌测试片上，37℃，培养18h。培养结束后，计数所有测试片上显示出蓝色的菌落。

对照方法：取样25g，按照GB 4789.4-2010的方式进行测定。

4 结果分析

4.1 识别性和特异性

通过检测，磁在快检测系统对沙门氏菌A、B、C、D、E不同血清型及常见沙门氏菌均可以有效富集及扩增（富集率>75%），对干扰菌大肠杆菌、粪肠球菌、奇异变形杆菌均能有效的抑制（均未生长），方法识别性和特异性良好。

4.2 不同菌浓度的回收效率

经测定，初始菌浓度为1.3×106CFU/mL，通过不同菌浓度测试，磁在快检测系统磁珠富集容量大于5×105CFU/mL，同时菌浓度处于10～105CFU/mL时，菌的回收率均大于85%。

4.3 不同体积的回收效率

结果显示，随着体积的增大，磁在快检测方法的回收率略有下降，从91.6%下降为78.8%，但是回收率仍大于75%，符合测试要求。

4.4 生鲜乳和猪肉中沙门氏菌的检测方法

检测样本也同时采用了国标法对样本进行对比检测，本实施例中的测试结果与国标法检测结果一致。各样本的定性检测结果如表4所示。实验结果显示20例猪肉样本中有5例检出含有沙门氏菌，20例牛奶样本有0例检出含有沙门氏菌。

经过比对，4份样品磁在快方法和GB 4789.4-2010方法一致，1份不一致从磁在快测试片挑取菌落经鉴定为沙门氏菌。

5 结论

通过实验验证，磁在快检测方法对沙门氏菌的捕获率均在80%以上，并有较高的特异性；免疫学结合生物化学技术快检方法与国标法相比较，测试结果与国标法检测结果一致，准确性无显著性差异，灵敏度达到10个cfu以下。测试片可直接观察菌落颜色即可对菌类做出鉴定，是一种高效、精准、操作简单的检测方法。免疫学结合生物化学技术快检方法优化了食品安全检测人员的工作方式，提高工作效率和检测可信度，对于中国食品安全的发展具有重大意义。

6 展望

食源性致病菌检测技术在不断的发展和创新过程中，每种技术都有各自的优势。多种技术的联用可大大提高检测的灵敏度，并缩短检测时间。随着微生物学、生物化学和分子生物学等学科的飞速发展，各种多功能微生物检测系统的研发正逐步成为热点。

参考文献：

[1] 孙秀兰，蒋栋磊，张银志.生物传感器应用于食源性致病菌检测研究进展[J].中国微生态学杂志，2011，23（11）：1040-1042.

[2] Groundwater P W，Todd A，Worsley A J，et al. The technology andtechniques used in the detection of pathogenic bacteria[J].Pharmaceuticaljournal，2009，283（7569）：281-282.

[3] 石晓路，扈庆华，张佳峰，等.多重实时PCR 快速同时检测沙门菌和志贺菌[J].中华流行病学杂志，2006，27（12）：1053-1056.

[4] Fitzmaurice J， Duffyb G， Kilbride B， et al. Comparison of a membrane surface adhesion recovery method with an IMS method for use in a polymerase chain reaction method to detect Escherichia coli O157：H7 in minced beef[J]. Journal of microbiological methods，2004，59：243-252.