牛磺酸对严重腹腔感染大鼠肠黏膜屏障功能的影响

蔡景融　武华　程巩

[摘要] 目的 通过建立大鼠严重腹腔感染模型，检测血浆二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO）的活性及D-乳酸含量，探讨牛磺酸对严重腹腔感染大鼠肠黏膜屏障的保护作用。 方法 实验于2015年5～7月将54只雄性SD大鼠随机分为三组：对照组（C组）、腹腔感染组（I组）和治疗组（T组），每组18只。C组仅轻微翻动盲肠后关腹，I、T两组采用盲肠结扎穿孔法（cecal ligation plus puncture，CLP）。T组于术后即刻腹腔注射牛磺酸溶液（200 mg/kg），而C组、I组术后即刻腹腔注射等体积生理盐水。各组分别于造模后6、12、24 h随机取6只大鼠，检测血浆DAO活性和D-乳酸含量。 结果 C组各检测指标在各时间点无明显差异，差异无统计学意义（P>0.05），I组、T组各检测指标均随时间延长呈增高趋势。I组、T组各检测指标在各时间点均高于C组，差异均有统计学意义（P<0.05），T组各检测指标在各时间点均低于I组，差异均有统计学意义（P<0.05）。 结论 牛磺酸对大鼠严重腹腔感染时肠黏膜屏障功能有一定的保护作用。

[关键词] 牛磺酸；腹腔感染；肠黏膜屏障；二胺氧化酶；D-乳酸

[中图分类号] R605 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2016）07-0022-03

[Abstract] Objective To explore the possible protective effect of taurine on intestinal mucosal barrier function in rats with severe abdominal infection through established the model of rats with severe abdominal infection， measuring the activity of diamine oxidase（DAO） and the concentration of D-lactic acid in plasma. Methods From May to July 2015 fifty-four SD males rats were randomly divided into three groups， 18 rats in each group）： control group （group C）， abdominal infection group（group I） and treatment group（group T）. The rats of group C were only slightly changed the cecal several times before definitive abdominal closure. The rats in group I and group T were established by cecal ligation and puncture （CLP）. The rats in group T received intraperitoneal injection of taurine（200 mg/kg） immediately after the operation， however， the rats in group C and group I received intraperitoneal injection of equivoluminal normal saline. Six rats in each group were randomly picked up at 6， 12， 24 h after operation to have the activity of diamine oxidase （DAO） and the concentration of D-lactic acid in plasma measured. Results There was no significant difference at each time point of each detection index in group C（P>0.05）. In group I and group T， each detection index was rising with increased postoperative time， and they were higher than those of group C at each time point， there was significant difference（P<0.05）. Compared with group I， each detection index of group T was lower at each time point， there was significant difference（P<0.05）. Conclusion Taurine has a certain protective effect on intestinal mucosal barrier function in rats with severe abdominal infection.

[Key words] Taurine； Abdominal infection； Intestinal mucosal barrier； Diamine oxidase； D-lactic acid

腹腔感染在普通外科较为常见，多由手术、创伤、消化道穿孔、急性胰腺炎、肠外瘘等原因导致。严重腹腔感染时，肠黏膜在各种致病因素作用下出现不同程度的损伤，通透性有所增加，肠道内的细菌（多为革兰阴性杆菌）和内毒素从肠腔经门静脉、淋巴循环移位可进一步引发全身炎症反应综合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS）、脓毒症、甚至多器官功能障碍综合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）[1]，病情严重，治疗费用昂贵。牛磺酸是一种由含硫氨基酸转化而来的β-氨基酸，由于其分子结构中的羧酸基被磺酸基取代，所以牛磺酸并不参与蛋白质的合成。急性炎症反应时，由于中性粒细胞嗜天青颗粒内髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）的催化作用，细胞内氧化应激产生的H2O2与Cl-、Br-反应生成次氯酸、次溴酸，而牛磺酸与两者相互作用，减轻了次氯酸、次溴酸对正常组织的氧化损伤，并生成具有杀菌、抗炎、抑制氧化应激的作用的牛磺酸氯胺、牛磺酸溴胺[2]。本实验通过多时间点比较各组大鼠血浆DAO活性、D-乳酸含量变化，探讨牛磺酸对大鼠腹腔感染早期肠黏膜屏障功能的保护作用，为将来临床应用提供一定依据。

1 材料与方法

1.1 动物来源

同系、出生日期相近、健康的雄性SD大鼠54只（重量200～230 g），购自山西医科大学动物实验中心，许可证号：SCXK（晋）2015-0001。造模前于山西医科大学生理实验室适应性饲养7 d，称重、编号。

1.2 主要试剂和仪器

牛磺酸（5 g）购于美国Sigma公司（北京索莱宝公司分装）、二胺氧化酶（DAO）及D-乳酸试剂盒均购于美国Sigma公司（由武汉博士德生物工程公司分装）。上海奔普电子天平（型号为BSM-180.4），德国Eppendorf台式低温离心机（型号为minispin），上海博讯电热恒温水浴锅（型号为HHSII-1），日本紫外分光光度计（型号UA-16A）。

1.3 牛磺酸溶液的配制方法

应用电子天平称取牛磺酸2 g，用量筒量取100 mL生理盐水，将称取的牛磺酸溶解于其中，配制成2%的牛磺酸溶液以备造模后使用，1周内有效。

1.4 实验分组和模型建立

实验于2015年5～7月将54只大鼠按随机数字表法分为三组，即对照组（C组）、腹腔感染组（I组）和治疗组（T组），每组18只。术前12 h禁食、不禁水。采用盲肠结扎穿孔法（cecal ligation plus puncture，CLP）制作严重腹腔感染模型[3]。步骤如下：①称重后腹腔注射10%水合氯醛（100 mg/kg）麻醉；②用医用橡皮胶带固定大鼠四肢后电推剃毛备皮、碘伏消毒；③于中、下腹做长度约2 cm的正中切口，沿中线逐层进入腹腔；④轻微翻动肠管、系膜，识别盲肠并将其暴露于腹腔外；⑤用丝线结扎盲肠盲端约1.5 cm，注意确保回结肠通畅；⑥使用18G注射器针头在盲端穿刺两对孔，挤出部分粪便；⑦还纳盲肠后分两层关腹，皮下注射预热37℃生理盐水（50 mL/kg）补液并防止休克，清醒后自由饮食。C组大鼠经开腹后轻微翻动盲肠后关腹，不行第⑤、⑥两步操作；I、T两组大鼠均行盲肠结扎穿孔术。T组大鼠术后腹腔注射牛磺酸溶液（200 mg/kg），C、I两组大鼠术后腹腔注射等体积生理盐水。术后分笼饲养，清醒后自由饮食。

1.5 DAO、D-乳酸检测

于造模后6、12、24 h三个时间点，每组随机选取6只大鼠，仍采用水合氯醛（100 mg/kg）腹腔注射麻醉，用一次性采血针取腹主动脉血约5 mL于真空采血管中，离心15 min（3000 r/min），取血浆上清液2 mL于EP管中，置于-20℃冰箱中储存待测。采血后应用颈椎脱臼法将大鼠处死。采用分光光度法，严格依照试剂盒说明书，逐步检测血浆DAO活性和D-乳酸含量。

1.6 统计学分析

应用统计学软件SPSS17.0对实验所得数据进行分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大体观察和腹腔情况

对照组（C组）：大鼠清醒后，可见其活动能力均较正常时稍有减弱，体温、心率以及呼吸频率正常，造模12 h后可见觅食行为；各时间点打开腹腔，均可见肠管能够正常蠕动，未见肠管扩张、粘连及明显腹水。腹腔感染组（I组）：大鼠清醒后逐渐出现体温升高、寒战，精神萎靡，反应迟钝，活动能力明显减弱，心率、呼吸频率明显增快，可见腹泻症状。腹腔可见肠管明显扩张、积气，回盲部粘连，腹腔有积液、积脓。盲肠表面可见脓性分泌物，盲肠盲端变黑、坏死。腹腔所见情况随造模后时间延长而加重。治疗组（T组）：大鼠清醒后逐渐出现体温升高、活动能力减弱，心率及呼吸频率加快，但程度均低于I组。腹腔可见肠管不同程度扩张、积气、回盲部粘连，肠管尚有蠕动，腹腔有积液，少量积脓，均较I组少。盲肠盲端变黑、坏死。

2.2血浆DAO活性的测定

C组各时间点DAO活性比较，差异无统计学意义（P>0.05），I、T两组DAO活性随着时间推移呈增高走势，且在相应的时间点均高于C组，差异均有统计学意义（P<0.05），T组DAO活性在各时间点均低于I组，差异均有统计学意义（P<0.05）。

2.3 血浆D-乳酸含量的测定

C组各时间点D-乳酸含量比较，差异无统计学差异（P>0.05），I、T两组D-乳酸含量随着时间推移呈增高走势，且在相应的时间点均高于C组，差异均有统计学意义（P<0.05），T组D-乳酸含量在各时间点均低于I组，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表2。

3 讨论

肠黏膜屏障是指机体能够防止肠腔内的细菌和毒素通过肠黏膜淋巴、血液循环而进入体内其他组织或器官的结构和功能的总和[4]。研究表明，严重腹腔感染时，肠黏膜出现不同程度的病理变化，如肠黏膜出现水肿、炎性细胞浸润、上皮细胞坏死脱落等，这一系列变化导致致病菌及内毒素移位，进而引起肠源性感染、内毒素血症，极有可能进展为全身炎症反应综合征[5]。因此肠黏膜损伤、通透性增加既是严重腹腔感染导致的结果，又是病情急剧恶化的主要原因之一。

严重腹腔感染时，肠黏膜会出现缺血再灌注损伤和炎症反应。从严重腹腔感染到SIRS、MODS的发生、发展过程中常伴有不同程度血流动力学改变，肠道血流量减少，而肠黏膜固有的绒毛微血管结构，使其对缺血、缺氧特别敏感，肠黏膜因缺血缺氧出现一定程度的损伤，然而恢复血液灌流后肠黏膜损伤进一步加重，即肠道缺血再灌注损伤。有研究表明，牛磺酸氯胺不仅可以氧化含有巯基的氨基酸、蛋白质，还能以N-Cl共价键的形式与细菌表面蛋白结合，进而降低细菌毒力、抑制细菌繁殖[6]；牛磺酸氯胺、牛磺酸溴胺能够抑制吞噬细胞活性，降低其消耗氧气并诱发呼吸爆发的能力，除此之外，牛磺酸氯胺可激活细胞质中转录因子NF-E2相关因子2（Nrf2）与细胞核内的抗氧化反应元件（ARE）结合，进一步增强一些抗氧化酶的表达，如血红素加氧酶、过氧化物氧化还原酶、硫氧还原蛋白等[7]；牛磺酸氯胺通过抑制核因子κB抑制蛋白激酶（IKK）的活性，减轻核因子κB抑制蛋白-α（IκB-α）的降解，防止因核因子κB（NF-κB）的激活所导致调控促炎因子（iNOS、TNF-α等）的基因序列转录增强[8]，这种抑制促炎因子形成作用呈剂量依赖性[9]。

肠黏膜屏障损伤时，肠道固有细菌大量增殖，代谢发酵产生的D-乳酸可通过受损肠黏膜入血，由于哺乳动物体内缺乏D-乳酸脱氢酶而代谢缓慢，故检测血浆D-乳酸含量变化能准确反映肠黏膜通透性变化[10]。95%以上的DAO储存于是小肠绒毛上皮细胞内，生理条件下血浆中含量甚微，其活性与肠黏膜上皮蛋白质、核酸代谢有关。肠黏膜屏障损伤后释放入血，当外周血增加的速度超过肝脏的清除速度时可被检测到，故检测血浆DAO活性可间接反映肠黏膜机械屏障的完整性[11]。目前，在实验研究中血浆DAO检测通常作为肠黏膜损伤的一个重要辅助标志物，其特异性为100%，准确性为95%，敏感性为94%[12-15]。

本研究结果显示，I、T两组大鼠大体观察及腹腔情况明显复杂于C组，体温、心率、呼吸频率均不同程度升高，腹腔均可见腹水、肠管粘连、盲肠盲端坏死等，但是T组整体程度较I组有所减轻。C组大鼠DAO活性及D-乳酸含量在各时间点比较并无明显差异，I、T两组大鼠DAO活性及D-乳酸含量随时间延长呈增高趋势，造模6 h后即出现轻微的肠黏膜损伤，通透性增加。随着时间的延长，造模24 h后I、T两组大鼠DAO活性及D-乳酸含量最高，说明此时I、T两组大鼠肠黏膜损伤最重，但是相较于I组，T组大鼠DAO活性及D-乳酸含量在相应时间点均低于I组，差异均有统计学意义（P<0.05），表明牛磺酸对大鼠严重腹腔感染时肠黏膜损伤有较好的保护、修复作用，具体机制和量效关系还待进一步研究，可为临床应用于肠内营养等提供一定依据。

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（收稿日期：2015-11-21）