肺痨康与耐异烟肼结核ahpC基因突变关系的研究

陈欢叶品良张传涛 等

【摘要】 目的：探讨肺痨康对耐异烟肼结核ahpC基因突变的影响。方法：采用全基因重测序的方法，对药物干预后的耐异烟肼结核模型小鼠肺组织结核杆菌基因组DNA进行重测序。以标准菌株（H37RV）为参考序列，筛选出与ahpC基因相关的突变位点，进行对比分析。结果：7个碱基突变位点的ahpC基因对应的密码子和氨基酸均未发生改变。肺痨康组和肺痨康联合异烟肼组的突变位点2729621，对应的密码子Gcc→Tcc，氨基酸由丙氨酸变为丝氨酸。结论：肺痨康对ahpC基因突变无修复作用，突变位点2729621，可能是肺痨康干预过的小鼠与未使用肺痨康干预过的小鼠之间的个体差异相关的单核苷酸多态性（SNP）位点。肺痨康抗结核的作用机制，需要参考与异烟肼耐药相关的其它基因的文献资料做进一步研究讨论。

【关键词】 肺痨康； 耐异烟肼结核； ahpC基因突变

The Research on Relationship between Feilaokang and ahpC Gene Mutation of Isoniazid-resistant Tuberculosis/CHEN Huan，YE Pin-liang，ZHANG Chuan-tao，et al.//Medical Innovation of China，2016，13（08）：001-004

【Abstract】 Objective：To explore the effect of Feilaokang on Isoniazid-resistant TB ahpC gene mutation.Method：Used the method of whole genome sequencing after drug intervention of isoniazid resistance tuberculosis mouse with lung tissue tuberculosis DNA analysis.In standard strains （H37RV） as the reference sequence，selected associated with ahpC gene mutations to make a contrastively analyzed.Result：Seven bases of ahpC gene corresponding codon and amino acid had not been changed.The feilaokang group and feilaokang combine isoniazid group 2729621 of gene mutation locus，the corresponding codon Gcc changed to Tcc，by alanine to serine.Conclusion：Feilaokang cant repair ahpC gene mutation locus 2729621 maybe is the single nucleotide polymorphism refer to individual difference between the mouse using feilaokng intervention with the mouse not using feilaokang intervention.The mechanism of feilaokang resistance TB need refer to more gene literature associated with isoniazid resistance to make further researching and discussion.

【Key words】 Feilaokang； Resistant-isoniazid tuberculosis； ahpC mututation

First-authors address：Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，Chengdu 610075，China

doi：10.3969/j.issn.1675-4985.2016.08.001

“肺痨康”是在历代医家辨治“肺痨”经验的基础上，根据临证经验不断总结组成的中药复方，主要由蒸百部、白及、天门冬、川贝母、北沙参、蛤蚧、阿胶等十一味中药组成，滋阴清热，润肺止咳，抗痨杀虫。临床观察发现，肺痨康可以促进肺部结核部分患者临床症状和肺部体征消失[1]。前期研究发现肺痨康能延长耐多药结核模型小鼠的存活时间，缓解肝、脾、肺的炎性反应，对耐药结核分枝杆菌具有明显的抗菌作用[2-4]。本研究以耐异烟肼结核小鼠模型为研究对象，运用基因组重测序的方法对模型小鼠进行DNA测序，拟证实肺痨康能修复与耐异烟肼耐药相关的ahpC基因的突变，为探究肺痨康的抗耐异烟肼结核分子机制提供基因依据。

1 实验材料

1.1 实验动物 SPF级昆明种小鼠120只（购自成都达硕生物科技有限公司，合格证号：SCXK（川）2013-24），雌雄各半，体重18～22 g，检疫后备用。小鼠自购买后，自由摄食饮水适应性喂养3 d，实验室环境温度控制在（25±2）℃。动物标准颗粒饲料购自成都达硕生物科技有限公司。

1.2 实验药物

1.2.1 肺痨康药液的制备及用量用法 肺痨康方剂中药物均购自北京同仁堂成都分店。将上述中药饮片采用传统方法一次性煎煮完毕。煎煮方法：将除阿胶、蛤蚧外的九味药物冷水浸泡1 h后煎煮3次，第1次煮沸后煎煮15 min，第2次煮沸后煎煮20 min，第3次煮沸后煎煮30 min，3次过滤的药液混合，趁热加入烊化好的阿胶及蛤蚧粉。用电子恒温水箱60℃低温将药液浓缩至含生药1 g/mL，放入4 ℃冰箱保存，每日取适量药液加热使用。前期实验得出高剂量肺痨康用量为6 g/kg灌胃时，对耐药结核治疗效果明显，经过换算后得出体质量20 g的小鼠肺痨康药液灌胃量约为0.12 mL/d。小鼠每3天称量一次体重，根据小鼠体重情况增减灌胃的药液量[3]。

1.2.2 异烟肼液的制备及用量用法 异烟肼片（100 mg/片，沈阳红旗制药有限公司生产，国药准字H21022350，产品批号：201309021）按照成人用量：0.3 g/d，1 次/d[5]。将异烟肼片磨成粉状，加入蒸馏水，混合均匀。以成人体重70 kg、小鼠体重20 g，按体表面积折算等效量比（成人：小鼠=1∶0.0026）进行计量换算，体重20 g的小鼠给药量为0.001 54 g/d[6]。将药物研末后加蒸馏水溶解稀释100倍，则20 g小鼠灌胃INH药量约为0.15 mL。

1.2.3 肺痨康联合异烟肼药液的制备及用量用法 肺痨康药液和异烟肼液等体积混合均匀，按6 g/kg体重计算，20 g重的小鼠需给予灌胃约0.12 mL。

1.3 实验主要试剂 1X Low TE Buffer （10 mM Tris-HCl，pH 8.0，0.1 mM EDTA）；50 xTAE concentrate Solution buffer（生工生物工程（上海）有限公司，SD8101-500mL）；MinElute PCR Purification（KitQiagen，136270849）；Qubit?dsDNA HS Assay Kit（Invitrogen，Q32854）；HiSeq PE Cluster Kit v4（Illumina，PE-401-4001）；HiSeq SBS Kit v4（Illumina，FC-401-4003）。

1.4 实验主要仪器设备 Qubit? 2.0 Fluorometer（Invitrogen，Q32866）；Magnetic Stand-96（Life Technologies，AM10027）；GeneAmp PCR System 9700（Life Technologies，4314878）；MicroCentrifuge（Eppendorf，5418）；cBot Clonal Amplification System（Illumina，SY-301-2002）；HiSeq 2500 Sequencing System（Illumina，SY-401-2501）。

1.5 实验菌株 H37RV标准结核分枝杆菌菌株（ATCC：27294）由中国疾病预防控制中心四川结核病预防控制分中心提供，含量为1 mg/mL含1×106 cfu；耐异烟肼结核分枝杆菌菌株20130332（000962.3）由中国疾病预防控制中心四川结核病预防控制分中心提供，含量为1 mg/mL含1×106 cfu。

1.6 实验场地 成都中医药大学基础医学院实验室；四川省疾病控制预防中心实验室，实验室备案证书：川卫BSL-2-A备（2009）第0081-01号；上海伯豪生物科技有限公司。

1.7 实验方法

1.7.1 动物造模及分组 SPF级昆明种小鼠120只，参照文献[7]采用小鼠尾静脉法建立耐异烟肼结核小鼠模型，选取80只SPF级昆明种小鼠，每只注射0.1 mL耐异烟肼菌悬液。将耐异烟肼结核小鼠随机分为耐异烟肼结核模型组、异烟肼组、肺痨康组、联合组，共四组，每组20只，再将其分别分笼编号。将H37RV标准菌菌悬液注入20只小鼠的尾静脉，每只0.1 mL，编为标准菌株组，对其进行分笼编号。剩下20只小鼠，作为空白组。

1.7.2 药物干预方法 造模1周后开始对6组小鼠进行药物灌胃干预。用配制好的异烟肼液、肺痨康药液、肺痨康联合异烟肼药液分别对异烟肼组、肺痨康组、联合组的小鼠进行干预。模型组和空白组的小鼠用生理盐水干预，按照20 g体重灌胃0.12 mL生理盐水的标准，随小鼠体重增减。以上五组小鼠均连续灌胃56 d。

1.7.3 标本的采集与保存 第57天脱颈椎处死小鼠，用75%酒精消毒小鼠体表5 min，无菌条件下解剖小鼠，完整取出双肺，用生理盐水冲洗，取小鼠肺门部位组织，约重0.1 g，放入无菌试管内，置冰箱保存。

1.7.4 基因组测序 随机从5个实验组中抽出1～2个小鼠肺组织样本，并将这些样本进行灭活，分离出结核分枝杆菌。采用DNeasy Blood & Tissue Kit （Qiagen，69506）设备，严格按照生产厂商提供的标准操作流程进行基因组DNA抽提及纯化。纯化后的DNA经Qubit? 2.0 Fluorometer和0.8%琼脂糖凝胶电泳进行质检，质检合格的DNA进行后续的测序实验。按照实验说明书对基因组DNA进行片段化，末端修复、3末端加A、连接接头、富集等步骤，完成测序样本文库构建。所建文库使用Qubit? 2.0 Fluorometer检测浓度，按照cBot User Guide所示相应流程，在Illummina HiSeq 2500测序仪配套的cBot上完成Cluster生成和第一向测序引物杂交。按照HiSeq 2500 User Guide准备测序试剂，将携有cluster的flow cell上机测序。测序过程由Illumina提供的data collection software进行控制，并进行实时数据分析。

1.8 数据处理 测序得到的原始图像文件，经过碱基识别及误差过滤，得到可以用于分析的原始测序片段称之为Reads。测序得到Raw Reads进行过滤，得到可用于数据分析的clean Reads。使用bwa软件（version 0.7.8）对预处理后的reads进行Genome mapping（参考基因组版本为：肺结核杆菌（M.tuberculosis）H37RV标准菌（REF）），利用samtools软件将原始文件转换为bam文件，Picard软件的Markduplicates工具用来标记可能的PCR重复，去掉可能的有PCR错误导入的假阳性突变，samtools的flagstat工具统计mapping信息。GATK的IndelRealigner 工具对bam文件中的存在INS/DEL的位点，或者已知的INS/DEL位点附近进行局部的多序列比对，减少因为插入缺失导致的reads边缘假的SNP位点；InDel结果由GATK UnifiedGenotyper对多个样品的bam文件同时处理，（保留Qual高于30的突变位点），Mapping生成的比对结果为BAM文件，结果由GATK Unified Genotyper对样品bam文件同时处理，得到的vcf文件，snpEff软件完成突变的注释，通过Perl脚本处理得到最终的结果。同一个项目下的所有样品方在同一个Excel表格下进行手工筛选比较。

2 结果

以ahpC基因为查找内容，手工筛选各excel表中snpEff软件完成突变的注释，模型组、肺痨康组、异烟肼组、联合组分别与标准菌株组对比，发现

5个相同的能影响的碱基突变位点，分别为2721562、2723252、2723506、2729058、2729832。5个碱基突变位点其分别对应的碱基突变为C→G、T→G、T→C、A→C、G→C。其中肺痨康组与模型组对比，发现多出一个突变位点2729621，碱基突变为C→A。异烟肼组与模型组比较，发现多出一个突变位点2726141，碱基突变为C→T。发现2729621、2726141这两个突变位点在联合组中均能找到。与标准菌株作序列对比的4个实验组的7个影响ahpC基因的碱基突变位点，与影响基因ahpC相对应的密码子、氨基酸均未发生变化，见表1；这些突变位点的影响基因均不单一，2729058、2729621位点发生错义突变，影响程度中等（MODERATE）。2729058密码子cTg→cGg，氨基酸由亮氨酸变为精氨酸。2729621仅出现在肺痨康组、联合组，密码子Gcc→Tcc，引起氨基酸丙氨酸变为丝氨酸。2721562、2723252、2723506、2729832发生沉默突变，影响小（LOW），不会影响蛋白质的功能和表达，其对应的氨基酸未被翻译出来。2726141引起的变异位于基因间区，密码子、氨基酸未发生改变，见表2。

3 讨论

耐异烟肼结核是指经体外药物敏感性试验证实，对异烟肼耐药的结核。异烟肼是治疗结核最常用的一线药物，其作用机制可能是抑制敏感细菌分枝菌酸的合成而破坏细胞壁结构的完整性。从1952年使用至今，已有63年的历史。可能由于异烟肼长期、广泛及不规范的使用，导致了异烟肼出现了全球性的耐药。根据2007年在中国做的全国性调查，表明有16%新发结核病例和38.5%已经治疗过的结核病例耐异烟肼[8]。耐异烟肼结核病一直被认为是发展成耐多药结核的第一步[multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB：是指结核病患者感染的结核分枝杆菌经体外药敏实验证实至少同时对异烟肼（isoniazid，INH或H）和利福平（rifampicin，RFP或R）两种以上一线抗结核药物耐药][9]。

目前已知的INH耐药相关突变基因有katG、inhA、kasA、ahpC、oxyR、ndh。KatG基因和inhA基因的突变仅能解释80%以上耐异烟肼菌株[10]，还有少部分的异烟肼耐药与kasA、ahpC、oxyR、ndh等基因相关。文献[11-12]提示，耐异烟肼结核杆菌ahpC的突变率为13.2%，ahpC突变引起ahpC蛋白的过量表达，降低过氧化物的浓度，从而阻抑了KatG介导的异烟肼活化，导致异烟肼耐药[13-14]。已经发现的密码子突变位点有-9、-46、-48、-49、

-50、-51、-52、-53、-54位（相对ahpC起始密码子）等[15]。本次实验研究显示，影响ahpC基因的碱基突变位点有7个，其影响密码子改变的位置均未在目前已经发现的突变位点上。ahpC基因对应的密码子、氨基酸未发生突变。这7个位点的等位基因频率均大于10%，可能是单核苷酸多态性（SNP）位点，可能与耐异烟肼结核分枝杆菌的易感染因素相关。肺痨康组、联合组与模型组、异烟肼组相比较，多出突变位点2729621，其对应的密码子Gcc→Tcc，氨基酸由丙氨酸变为丝氨酸。该位点可能是肺痨康干预过的小鼠与未使用肺痨康干预过的小鼠之间的个体差异的相关位点。肺痨康与修复ahpC基因突变相关的假设不成立，肺痨康抗结核的作用机制，需要参考与异烟肼耐药相关的其他基因的文献资料，做进一步研究讨论。

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（收稿日期：2015-11-19） （本文编辑：蔡元元）