不同产地人参指纹图谱研究对比

林伟斌

人参在医疗或养生方面都有可观的价值，而不同产地的人参由于环境、气侯、水土等因素影响，其成分也有所不同，故市场上流通的人参存在不少非原产地以次充好，以假乱真的现象。

目前中药指纹图谱中应用最多的方法是高效液相色谱法，因为其对样品挥发度和热稳定性限制小，兼具高柱效、高选择性、灵敏度高的优点，比较适合中药材复杂体系的分析。所以，在参考前人的研究基础上，利用高效液相色谱法对人参药材进行多维谱图条件研究，寻找不同产地人参之间的识别因子以及通过人参药材与制剂指纹图谱的相关性分析，能科学评价及有效控制人参质量。

仪器与试剂

仪器。美国Agilent 1200 高效液相色谱仪；德国sartorius CP224S电子分析天平；天津奥特赛恩斯AS20600BDT超声波清洗仪；上海菲恰尔TDL-5A离心机。

试剂。乙腈（色谱纯，美国TEDIA公司）；磷酸（优级纯，国药集团化学试剂有限公司）；甲醇（分析纯，广州化学试剂厂）；乙醇（分析纯，广州化学试剂厂）；人参皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Re、Rf、Rg1（中国药品生物制品检定所）；Rc、Rd、Rh1（北京恒元启天化工技术研究院）

样品。本实验共收集人参药材26批，其中吉林12批，辽宁10批，北京、山东、加拿大、东北各1批。药用部位均为人参主根。

实验方法

色谱条件。色谱柱：phenomenex Kinetex C18 100?（100×4.6mm，2.6μm）；检测波长：203nm；柱温：25℃；流速：1.0mL/min；流动相：以乙腈为流动相A，0.1%磷酸溶液为流动相B，洗脱程序：0～17.5min，乙腈

19%，17.5～22.5min，乙腈变化到29%，22.5～35min，乙腈保持在29%，35～50min，乙腈变化至40%；分析时间：50min；进样量：5μL。

对照品溶液的制备。精确称取人参皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Re、Rh1、Rf、Rg1对照品适量，加甲醇溶解分别制成0.2mg/mL的对照品溶液。

供试品溶液的制备。取粉末（过四号筛）2g，精密称定，置具塞离心管中，加入70%甲醇20mL，超声提取（功率500W，频率40kHz）60分钟，3000转离心10分钟，上清液转移至50mL量瓶中，滤渣再加入70%甲醇20mL，再超声提取60分钟，离心，上清液转移至50mL量瓶中，用70%甲醇分次洗涤离心管，合并滤液，定容至刻度。经0.45μ m微孔滤膜滤过，取续滤液备用。

方法学考察

指纹图谱分析与建立。精密吸取对照品溶液和吉林供试品溶液各5μL，注入液相色谱仪，记录60分钟的色谱图。根据多批样品的指纹图谱给出的相关参数，所有组分在60分钟全部出峰。选取分离度以及峰形均较好的5～60分钟比较供试品谱图，其中19个峰为共有峰。根据保留时间确定5号峰为人参皂苷Re，是人参的指标成分之一，将其作为内参比峰。

精密度试验。精密称取吉林人参药材，按方法操作，制备供试品溶液。在色谱条件下，连续进样5次，记录指纹图谱。计算各共有峰相对于内参比峰的相对保留时间和相对峰面积比值。试验数据见表1。结果表明，各色谱峰的相对保留时间和其相对峰面积比值的RSD均小于3.0%，表明方法精密度良好，符合指纹图谱技术要求。

稳定性试验。精密称取吉林人参药材，按方法操作，制备供试品溶液。在色谱条件下，分别在0、2、4、8、16小时进行分析，记录色谱图。计算各共有峰相对于内参比峰的相对保留时间和相对峰面积比值。试验数据见表2。结果表明，各色谱峰的相对保留时间和其相对峰面积比值的RSD均小于5.0%，符合指纹图谱技术要求。

结果

辽宁人参药材HPLC指纹图谱中共有指纹峰的标定与技术参数的设定。将10批产自辽宁的人参指纹图谱中各共有色谱峰的相对保留时间、相对峰面积，及其指纹图谱输入国家药典委员会指定的中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A）中，进行图形匹配及其数据匹配后，建立了供试品指纹图谱的共有模式，当中含有共有峰22个。取下对照品溶液，在色谱条件下，分别注入液相色谱仪，根据保留时间确定以上各种人参皂苷在谱图中的位置，可确定22个共有峰中，5、6、9、12、13、14、16、17、20号峰分别为人参皂苷Rg1、Re、Rf、Rh、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd。

讨论

提取方法的选择。根据人参药材的主要成分特性，结合文献资料，实验对索氏除杂后超声提取、加热回流提取法、超声振荡法、加热回流后液液萃取、超声提取后液液萃取等多种方法进行了考察。结果显示，超声振荡法操作简便易行，便对这种方法作进一步优化。采用70%甲醇和70%乙醇为提取溶剂，不同提取时间进行对比，结果表明，70%甲醇的样品峰面积较70%乙醇的样品峰面积大，并且随着提取时间增加，峰面积也随之增加。浸泡过夜后超声与直接超声处理相比较，浸泡过夜稍好，但差异并不明显。因此，本文采用70%甲醇直接超声提取2次，每次60分钟作为人参药材提取方法。

流动相的选择。实验对乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.5%磷酸溶液3种溶剂系统进行梯度洗脱，以乙腈-0.1%磷酸溶液系统所得图谱的峰形较好、分离度大。所以选用乙腈-0.1%磷酸溶液流动相系统为本实验的流动相系统。

色谱柱的选择。分别采用phenomenex Kinetex C18 100A（100×4.6mm，2.6μm）、phenomenex Luna 5μ C18（2） 100A（150×4.6mm，5μm）、phenomenex Synergi 4μ Hydro-RP 80 A（250×4.6mm，4μm）、Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18（150×4.6mm 5μm）、Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（150×4.6mm 5μm）进行洗脱。结果表明：phenomenex Kinetex C18 100A柱洗脱出的色谱峰基本平稳，峰数多且分离度好，所以选用phenomenex Kinetex C18 100A柱作为本实验的色谱柱。

柱温的选择。分别选用25℃、30℃、35℃、40℃等4种柱温进行试验。结果表明：25℃时分离效果最好，所以选用25℃作为本实验的柱温。

不同产地人参指纹图谱的比较。各产地的人参药材的HPLC指纹图谱存在较大差异，北京、山东、加拿大均不含有人参皂苷Rf，但此3个产地的人参皂苷Rb1、Re、Rc的含量则比东北、吉林、辽宁的高。这说明以上 6个产地的人参药材由于生长的地理环境、纬度和气候的不同而导致主要化学成分含量差别很大。

指纹图谱相似度。本实验建立的指纹图谱分析方法预处理简单，色谱条件优越，出峰数量多且大多数组分达到了基线分离，指纹图谱相似度均在0.90～1.00之间，在分析未知样品时，凡未知样品与标准样本间的相似度达到以上标准，其他项目均符合质量标准时，均可作为合格药材入药。

指纹图谱HPLC条件：色谱柱：phenomenex Kinetex C18 100A（100×4.6mm，2.6μm）；流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液（梯度洗脱）；检测波长：203nm；柱温：25℃；流速：1.0ml/min；分析时间：50min。

结论

产地为吉林的人参指纹图谱共标示出19个共有峰；产地为辽宁的人参指纹图谱共标示出22个共有峰。利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统，测得12批吉林的人参指纹图谱相似度结果均在0.90～1.00之间；10批辽宁的人参指纹图谱相似度结果均在0.90～1.00之间。

该人参指纹图谱分析方法预处理简单，色谱条件优越，出峰数量多且大多数组分达到了基线分离，可为有效控制人参药材的质量提供可靠的依据。

（作者单位：无限极（中国）有限公司）