等温扩增荧光技术快速检测金黄色葡萄球菌方法的建立

王耕 张薇 陈安东 王振超

等温荧光扩增技术--Isothermal Amplification Fluorescent Method（IAFT）是核酸体外扩增和荧光法技术的结合，在恒温条件下进行，通过添加特殊的DNA聚合酶和特异性引物，在扩增的同时加入荧光基团，通过荧光信号累积实时监控扩增过程，实现核酸快速扩增和检测，并对产物做溶解曲线分析。本研究针对金黄色葡萄球菌特异性的femA基因片段设计并筛选出了IAFT法的特异性引物，验证特异性和灵敏度，并与传统检测方法做对比，结果符合率为100%。

实验仪器及材料

材料：金黄色葡萄球菌菌液，藤黄八叠球菌菌液，大肠杆菌菌液，引物（5条），IMM（optigene Limited公司），细菌基因组核酸提取试剂盒（STP），仪器：Optigene limited Genie Ⅲ。

实验步骤

（1）引物稀释：将引物稀释成下表浓度：FIP（上游内引物）40pmol/uL，BIP（下游内引物）40pmol/uL，F3（上游外引物）5pmol/uL，B3（下游外引物）5pmol/uL，LF（上游环引物）20pmol/uL；

（2）实验体系：IMM15ul；引物 FIP、BIP、F3、 B3，LF 各1ul，样品5ul；

（3）反应程序设定，65℃反应40min，溶解曲线 98-80℃。0.05℃为一个循环；

（4）样本制备：分别使用提取试剂盒和加煮沸法制备核酸同时检测，比对实验结果。试剂盒提取时参照试剂盒说明书，煮沸法取菌液1ml，95℃加热10分钟，离心取上清。

实验结果：

图1 实验结果显示，只有金黄色葡萄球菌对应的1、2孔有阳性扩增，其他菌株和阴性对照均未出现扩增，结果特异。其中使用试剂盒提取的样本起峰时间较早，煮沸法的样本出峰时间较晚。

图2 特异性溶解曲线分析，针对产物做温度退火同时检测荧光值，相同样本峰值重合。

综上所述，本研究通过金黄色葡萄球菌的基因分析和比对，设计和筛选特异性引物，优化样品前处理，确立实验程序和规范，完成特异性实验，常规方法比较，验证和建立了金黄色葡萄球菌的快速检测技术。

讨论

本研究使用等温扩增荧光法 （IAFT）为基础建立了金黄色葡萄球菌的检测体系，与传统方法进行对比，其结果符合率达到100%。根据上述实验结果，样本仅需一步增菌即可上机进行检测，除了可以使用试剂盒提取纯度较高的核酸样本进行扩增和检测外，煮沸法抽提同样适用，且准确率与传统方法一致。

结论

（1）集成核酸等温扩增核心技术，以等温扩增荧光快速检测技术为基础建立了金黄色IAFT法快速检测技术体系。

（2）分析金黄色葡萄球菌及同源性较高的其他细菌的特异性核酸序列，经序列比对找到靶基因进行引物设计和筛选，保证所选引物对金黄色葡萄球菌核酸序列的扩增高度特异

（3） 经与传统方法以及PCR法进行比价和评价，其准确率与传统培养法完全一致，且更为特异、敏感、精确、快速和便捷，适合于任何条件下的现场快速检测，可对由金黄色葡萄球菌和其他常见的致病微生物进行快速鉴定和诊断，可作为微生物检测的快速鉴定技术，推广和应用前景广阔。

（作者单位：北京晟泰勃科技有限公司 ）