绞股蓝皂苷发酵产物对小鼠免疫功能的影响

宁豫昌　乔宏兴　潘春梅　张晓静

摘要：采用HPLC对发酵前后的绞股蓝皂苷（Gvpenoside）进行了分析，选用75只健康小鼠，随机分为阳性对照组、阴性对照组、低剂量试验组、中剂量试验组、高剂量试验组共5个处理组，每组5只小鼠，3个重复。阴性对照组每日灌服0.5mL生理盐水，阳性对照组每日灌服0.5mL未发酵的绞股蓝皂苷溶液，3个试验组分别每日灌服发酵的绞股蓝皂苷溶液0.2、0.5、0.8mL，连续灌服10d。结果表明，HPLC分析显示，经枯草芽孢杆菌发酵后的绞股蓝皂苷成分发生了明显变化，且与对照组相比，经过发酵的绞股蓝皂苷能够显著提高小鼠的脾脏指数和胸腺指数（P<0.05），同时还能显著提高小鼠血清中IgG和IgA的含量（P<0.05），对小鼠血清中IL-2的产生也有一定的促进作用。说明枯草芽孢杆菌对绞股蓝皂苷具有一定的生物转化作用，且经微生物转化后的绞股蓝皂苷具有促进小鼠免疫器官发育和增强体液免疫的功效。

关键词：绞股蓝皂苷；枯草芽孢杆菌；发酵；小鼠；免疫功能

中图分类号：R285.5；R593 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）09-2304-04

绞股蓝[Gynostemmapentaphyllum（Thunb.）Makion]为葫芦科（Cucurbitaceae）绞股蓝属（Gyuos-temma）植物，在动物医学上具有抗肿瘤、增强免疫、镇静止痛等作用。药理学研究表明，绞股蓝含有多种化学成分，其中以绞股蓝皂苷为主要的药理活性物质。近年来。随着中药制剂研究的不断深入。国内开展了利用微生物发酵技术对中草药有效成分进行生物转化作用的研究，但是目前国内关于绞股蓝皂苷微生物转化作用的研究尚不多见，如陈良华等的研究表明，黑曲霉可对绞股蓝皂苷进行生物转化。且转化后的成分具有抗癌活性：朴香兰等的研究证明，经保加利亚乳杆菌发酵转化后的绞股蓝皂苷较转化前具有更强的抗癌活性。但是，上述研究均未表明绞股蓝皂苷经微生物转化后，其转化成分是否还具有诸如增强免疫器官指数和体液免疫水平等其他的生物学特性。因此，本研究将以绞股蓝皂苷为底物，利用微生物对其进行发酵，并检测发酵后的绞股蓝皂苷对小鼠的各项免疫功能具有何种作用，从而为微生物发酵绞股蓝在畜牧业上的应用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

绞股蓝原药购自河南顺康医药有限责任公司：发酵用菌种为河南牧业经济学院微生物实验室保存的枯草芽孢杆菌，

1.2 试验方法

1.2.1 绞股蓝皂苷的提取与发酵 用粉碎机将适量的绞股蓝粉碎，以25倍量（m/v）的75%乙醇溶液80℃提取2h，将提取液过滤并减压浓缩成浸膏状，将浸膏用适量蒸馏水悬浮，在梨形分液漏斗中用正丁醇萃取3次，萃取液减压浓缩后再经旋转蒸发后得到干燥的绞股蓝皂苷发酵底物。将绞股蓝皂苷发酵底物按3%比例加入液体转化培养基（葡萄糖1.0g，KH₂PO₄1.0g，蛋白胨5.0g，MgSO₄·7H₂O0.5g，蒸馏水1000mL），经高压蒸汽灭菌后备用。将枯草芽孢杆菌按5%接种到上述培养基，于37℃静置培养4d。

1.2.2 绞股蓝皂苷发酵产物的HPLC检测 发酵结束后，将发酵液10000r/min离心5min，取上清液用等体积的饱和正丁醇萃取3次，所得有机溶剂在45℃减压浓缩得残留物，将残留物中加入2mL甲醇，用0.45μm微孔滤膜过滤，备用。分别将绞股蓝皂苷发酵后的提取物与未发酵的绞股蓝皂苷进行HPLC分析。HPLC的分析条件为，色谱柱：PhenomexC₁₈柱（250min×4.6min×5μm）；柱温30℃；检测波长203nm；进样量20μL；流速1.0mL/min；流动相为水（A）/乙腈（B）梯度洗脱：洗脱程序如表1所示。

1.2.3 绞股蓝皂苷发酵产物对小鼠免疫器官指数的影响75只体重20g左右的健康小鼠，平均随机分为5组，每组5只小鼠，3个重复。分别为阴性对照组、阳性对照组、低剂量试验组、中剂量试验组、高剂量试验组，其中阴性对照组每只小鼠每日灌服0.5mL生理盐水，阳性对照组每只小鼠每日灌服未经发酵的绞股蓝皂苷溶液f绞股蓝皂苷：水：1：1，V：V）0.5mL。低剂量、中剂量和高剂量试验组每只小鼠每日灌服经过发酵的绞股蓝皂苷溶液0.2、0.5、0.8mL，各组小鼠连续灌服10d，常规饲养管理。试验期结束后24h，将各组小鼠摘眼球采血处死。利用精密电子天平称量体重后，分别摘取脾脏和胸腺并称重，计算脾脏指数（脾脏重/体重）和胸腺指数（胸腺重/体重）。

1.2.4 绞股蓝皂苷发酵产物对小鼠体液免疫因子的影响 上述各组小鼠摘眼球采血后，将血液离心获得血清，分别测定各组小鼠血清中的IgG、IgA、IL-2含量，具体方法按照各相应的ELISA检测试剂盒说明书进行。

1.2.5

数据统计分析 数据均以平均值±标准差表示，应用SPSS13.0统计分析软件进行单因素方差分析和多重比较。

2 结果与分析

2.1 绞股蓝皂苷发酵产物的HPLC检测

由图1可知，未经发酵的绞股蓝皂苷只在26.0min和28.0min处有2个峰，而经过枯草芽孢杆菌B9株发酵作用的绞股蓝皂苷，其26.0min和28.0min处的2个峰面积明显减小，并且在29.9-35.2min之间出现了6个新的峰，说明枯草芽孢杆菌对绞股蓝皂苷具有明显的生物转化作用。

2.2 绞股蓝皂苷发酵产物对小鼠免疫器官指数的影响

由表2可知，各试验组的脾脏指数均大于阴性对照组和阳性对照组，其中低剂量试验组与阴性对照组、阳性对照组间的差异不显著，而中剂量试验组和高剂量试验组相比阴性对照组、阳性对照组均差异显著（P<0.05），高剂量试验组的脾脏指数亦显著大于中剂量试验组（P<0.05）。各试验组的胸腺指数均显著大于阴性对照组和阳性对照组（P<0.05）。各试验组中，中剂量试验组和高剂量试验组的胸腺指数显著高于低剂量试验组（P<0.05）。高剂量试验与中剂量试验组差异不显著。结果表明，相比发酵前的绞股蓝皂苷，绞股蓝皂苷发酵产物能够提高小鼠的免疫器官指数，且作用效果与浓度间呈正相关。

2.3 绞股蓝皂苷发酵产物对小鼠体液免疫因子的影响

由表3可见，相比阴性对照组和阳性对照组，中剂量和高剂量的发酵绞股蓝皂苷均能显著提高小鼠血清中的IgG和IgA含量（P<0.05），但中剂量试验组与高剂量试验组间的IgG和IgA含量无显著差异：小鼠血清中的IL-2含量在各处理组间均无显著差异，但是可以看出，各试验组小鼠血清中的IL-2含量仍然高于阴性对照组和阳性对照组。结果表明。中、高剂量的绞股蓝皂苷发酵产物对小鼠的体液免疫具有促进作用。

3 讨论

3.1 绞股蓝皂苷发酵产物的HPLC分析

研究表明，微生物能够分泌产生各种活性较强的胞外酶系，如蛋白酶、淀粉酶、果胶酶、纤维素酶、糖苷酶等，利用微生物丰富的胞外酶，人们广泛地开展了中草药的微生物发酵转化研究，证明微生物可以将中草药中的某些有效成分作为前体，通过酶的作用转化为新的代谢产物。王明君等利用朱红密孔菌将香草酸转化生成了香草醛。严梅桢等研究证明，黄芩经肠道微生物转化后，生成了新的活性成分，其体内和体外的抑菌活性均得到提高。绞股蓝皂苷是绞股蓝中主要的药用成分，与人参皂苷同属达玛烷型四环三萜类皂苷，目前关于人参皂苷的微生物转化研究进行的比较深入，研究证实微生物转化人参皂苷的主要机理是微生物以皂苷侧链上的糖基为碳源，通过酶的水解作用减少或切除皂苷分子中的糖链，从而获得一系列低分子量的皂苷或苷元。但是，目前关于绞股蓝皂苷的微生物转化研究刚刚起步，已经发现的对绞股蓝皂苷具有转化作用的微生物有黑曲霉和保加利亚乳杆菌，本研究中，利用实验室保存的猪源枯草芽孢杆菌B9株作为发酵菌种对绞股蓝皂苷进行发酵，通过HPLC分析发现，经过发酵的绞股蓝皂苷原有的2个吸收峰面积明显降低，并且有新的吸收峰产生，说明枯草芽孢杆菌B9株对绞股蓝皂苷也有明显的生物转化作用，但其作用机理还有待进一步研究。

3.2 绞股蓝皂苷发酵产物对小鼠免疫器官指数的影响

胸腺是动物机体内重要的中枢免疫器官，是哺乳动物T淋巴细胞分化成熟的场所，脾脏则是动物机体内最大的外周免疫器官，参与全身的体液免疫和细胞免疫，因此，胸腺和脾脏对于维持机体的细胞和体液免疫具有重要作用，它们的功能状态直接影响到机体免疫水平的高低。Rivas等的研究证明，胸腺和脾脏在动物机体内所占的相对重量可以非常直观的反映出机体内细胞免疫和体液免疫状态的好坏：康佳的研究表明，超微发酵的绞股蓝能够明显提高小鼠的脾脏指数和胸腺指数，本研究表明，相比未发酵的绞股蓝皂苷，经过微生物发酵的绞股蓝皂苷，即便是较低的浓度，均能够提高小鼠的脾脏指数和胸腺指数，且其作用效果与其浓度间有量效关系。说明相比未发酵的绞股蓝皂苷，经过发酵的绞股蓝皂苷，在促进免疫器官发育方面的药效得到了明显提高，这与康佳的研究类似。

3.3 绞股蓝皂苷发酵产物对小鼠体液免疫因子的影响

IgG是哺乳动物体液内最主要的免疫球蛋白，约占血液中免疫球蛋白总量的70%-75%，其在激活补体、增强抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用，以及中和病毒与细菌毒素等方面发挥着重要作用。IgA在健康动物体液中的含量仅次于IgG，具有IgG的某些功能，主要在黏膜免疫中发挥作用。IL-2即白细胞介素-2，是免疫应答中产生的重要介质，能够刺激T淋巴细胞进入生长周期，并能促使B淋巴细胞增殖和产生免疫球蛋白，此外还具有促进T淋巴细胞杀伤活力、增强自然杀伤细胞活性等多种免疫调节功能。本研究发现，经过微生物发酵的绞股蓝皂苷具有显著地调节机体体液免疫功能的作用，能有效提高动物机体的免疫力。试验中，相比阴性对照组和阳性对照组，各试验组均能不同程度地提高小鼠血清中IgG和IgA的水平，其中中剂量试验组和高剂量试验组的作用效果更加显著：相比对照组，各试验组对IL-2水平的提高作用虽然并不显著。但仍有一定效果。试验说明，相比未经发酵的绞股蓝皂苷，微生物发酵后的绞股蓝皂苷对于小鼠体液免疫的提高具有一定的促进作用。

4 结论

枯草芽孢杆菌对绞股蓝皂苷具有一定的生物转化功能，且经过微生物转化的绞股蓝皂苷，对动物机体的免疫器官发育和体液免疫因子生成均具有一定的促进作用。