污染土壤中重金属Cr吸附菌株的筛选与鉴定

李军　杨卓　纪宏伟　门明新

摘要：以Cr污染土壤为菌源样品，富集培养与菌株分离后，采用二苯碳酰二肼分光光度法从中筛选Cr吸附菌株，共筛选分离出4株高效吸附重金属Cr的细菌菌株。通过形态观察、生理生化试验对4株菌株进行了种属鉴定，初步鉴定4株菌株均为芽孢杆菌（Bacillus）。

关键词：土壤污染；重金属Cr；吸附；菌株筛选；种属鉴定

中图分类号：X53 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）09-2218-04

随着社会经济和工农业的发展，中国甚至全球许多国家面临严重的Cr污染威胁，土壤Cr污染已成为人们普遍关注的环境污染问题之一。Cr盐、皮革、印染、电镀等涉Cr工业的发展以及城市污水的非达标排放对农业土壤已造成一定的毒害，其危害由于生物放大作用也逐渐威胁人类健康。因此，Cr被列为中国农田土壤环境质量评价的8个重金属控制指标之一。

土壤中的Cr最初来源于岩石风化，在自然条件作用下转移到成土母质及土壤中：其次，随着城市化的推进。城市污水灌溉、污泥及城市垃圾正在成为土壤Cr的另一个主要来源；另外，随着冶金、制革、电镀等涉及Cr污染工业的发展，某些工厂和Cr污染源所产生的含Cr粉尘、Cr渣及被Cr污染的地下水也能通过各种途径进入土壤造成Cr的累积。通常，低浓度的Cr对多种农作物的生长有刺激作用，但是高浓度的Cr则会危害农作物。另一方面人类食用Cr含量超标的粮食、蔬菜后，进入人体，很可能会诱发多种慢性疾病的发作。

Cr污染土壤的治理途径主要有两种：一是改变Cr在土壤中的存在形态，将Cr⁶⁺还原成Cr³⁺，降低其在环境中的迁移能力和生物可利用性：二是将Cr从被污染土壤中清除。根据以上两种思路发展出生物修复、工程修复、加入改良剂及农业措施等治理方法，但是生物修复技术中利用微生物处理污染土壤中重金属Cr是目前实践证明最有发展前途的一种新的重金属污染处理方法，与传统的处理方法相比，其具有无二次污染、处理效率高、适应范围广、成本低等优点，在治理土壤重金属污染中有着很大的应用前景，具有很高的研究价值。本研究目的是从污染土壤中筛选、分离高效吸附重金属Cr的细菌菌株。并且对吸附能力较高的菌株进行种属鉴定，以期为生物技术治理土壤Cr污染提供菌种资源，并为其进一步研究奠定科学基础。

1 材料与方法

1.1 菌源样品

污染土样：采用五点法，取污水处理厂周边（表1）的土壤样品混合。铲去表面土层。取5-10cm深处的土壤，装入无菌袋，记录取样地点、时间等，带回实验室，4℃冰箱保藏备用。

1.2 培养基

1.2.1 菌株分离筛选培养基 ①基础培养基。NA培养基：用于菌株的分离及保存；NB培养基：用于菌株液体培养及种子制备。⑦富集培养基。含100、300、500mg/LCr⁶⁺的液体培养基，用于重金属Cr吸附菌株的富集培养。③初筛培养基——分离培养基。NA培养基基础上添加终浓度为500mg/L的Cr⁶⁺，用于菌株分离、驯化。

1.2.2 复筛培养基

NB培养基，用于菌株培养获得菌泥，以测定菌株对Cr的吸附能力。

1.2.3 菌种鉴定培养基

根据常见细菌系统学鉴定手册配制。

1.3 试验方法

1.3.1 Cr吸附菌株的分离筛选——菌株的富集、分离及纯培养 取5.0g土样于含100mg/LCr⁶⁺的液体富集培养基中摇床培养3d，转接3次，富集培养液的Cr⁶⁺浓度以200mg/L递增，直到Cr⁶⁺浓度达到500mg/L。将驯化后的菌株培养液涂布于含500mg/L Cr⁶⁺的NA培养基中，37℃培养。将菌落生长特征不同的菌株挑取到NA斜面上培养，37℃培养至菌苔长满，置于4℃冰箱备用，用于进一步地筛选、鉴定。

1.3.2 Cr⁶⁺标准曲线的绘制 向一系列50mL比色管中分别加入0、0.20、0.50、1.00、2.00、4.00、6.00、8.00和10.0mL Cr⁶⁺标准溶液，用水稀释至标线。向比色管中加入2mL显色剂。摇匀，放置10min，在540nm波长下，以去离子水作为参照。测量吸光度。绘制Cr⁶⁺含量对吸光度的标准曲线。

1.3.3 菌株复筛——菌株吸附Cr⁶⁺能力测定 制备初筛菌株的菌泥备用。三角瓶中装入浓度为1000μg/L的Cr⁶⁺标准液，接入菌泥，充分振荡摇匀后摇床培养，以不接菌泥作为对照。每1h取样1次，以5000r/min离心10min，采用二苯碳酰二肼显色一紫外分光光度法测定上清液中Cr⁶⁺的浓度，以此确定各菌种对Cr⁶⁺的吸附情况。每个样品3次重复。按以下公式计算菌体对Cr⁶⁺的吸附率（Q）：Q：[（C₀-C_t）/C₀]×100%。式中，C为重金属离子初始浓度（mg/L），C_t为重金属离子平衡浓度（mg/L），挑选出吸附效果最好的菌种，用于菌株种属鉴定。

1.4 菌株种属鉴定

首先进行菌落形态观察，将所得菌株划线接种于固体平板上，37℃培养24h，观察单菌落形态。然后进行革兰氏染色试验，最后进行生理生化试验，根据常见细菌系统学鉴定手册进行。

2 结果与分析

2.1 Cr吸附菌株的富集与分离

通过对菌液进行观察发现，随着Cr⁶⁺浓度的增加，菌落的数量明显减少。Cr⁶⁺浓度为500mg/L时，选择合适稀释浓度涂布的培养基平板，对生长较好的细菌进行分离纯化，得到18株形态各异的Cr吸附细菌，编号为A-1、A-2、B-1、B-2、C-1、CX-9-1、CX-9-2、D-1、E-1、E-2、F-1、G-1、H-1、I-1、K-1、M-1、N-1、O-1，将所筛选的菌株接种到NA斜面培养基上备用。

通过对18株菌株的菌落形态观察，初步判断为细菌菌落，圆形或近圆形、湿润不透明，详细描述见表2。

2.9 菌株吸附Cr⁶⁺能力测定

Cr⁶⁺浓度（x）与吸光度（y）的标准曲线见图1，各菌株对Cr的吸附情况见表3。由表3可以看出，菌株对重金属Cr的吸附作用存在差异，按2h时的吸附能力排序为H-1=M-1>CX-9-1>CX-9-2>E-1=G-1>F-1>N-1>0-1>A-1>I-1>B-1>K-1>B-2>D-I>A-2>E-2>C-1，其中对重金属Cr吸附效果排前4位的4株菌株在处理2h时的吸附率分别达98.86%、98.86%、97.02%、96.73%，说明这4株菌株具有较好的应用前景。

2.3 4株菌株的种属鉴定

2.3.1 菌落特征 CX-9-1菌落直径为1.0cm，呈圆形，白色，边缘不整齐，容易挑取，中间有隆起，菌落不透明，有褶皱，表面干燥：CX-9-2菌落直径为0.9cm，呈圆形，白色，边缘整齐，不容易挑取，中间有隆起，菌落不透明，无褶皱，表面干燥；H-1菌落直径为0.3cm，呈圆形，微黄色，边缘不整齐，容易挑取，扁平，菌落不透明，无褶皱，表面湿润：M-1菌落直径为0.2cm，呈不规则圆形，微黄色，边缘整齐，不容易挑取，中间有隆起，菌落不透明，无褶皱，表面湿润（表2）。根据以上形态特征初步判断4株菌株均为细菌菌落，菌落形态见图2。

2.3.2 菌体形态特征 供试菌株经革兰氏染色后在显微镜下观察，都为杆菌，CX-9-1、M-1革兰氏染色呈阳性（图3）。

2.3.3 生理生化试验结果 生理生化试验包括V.P试验、硝酸盐还原试验、淀粉水解试验、接触酶试验、葡萄糖氧化发酵试验、柠檬酸盐试验等18项，试验结果如表4所示，根据试验结果与《常见细菌系统鉴定手册》作初步判断，判定CX-9-1、CX-9-2、H-1、M-1四株菌株均为芽孢杆菌（Bacillus）。结果为土壤Cr污染的微生物治理提供了菌种资源，并为其进一步深入研究奠定了科学基础。

微生物吸附法去除土壤中Cr⁶⁺的研究较少。Srivastava等研究表明，土壤中Cr⁶⁺含量为250mg/kg、黑曲霉作为吸附剂时，15d内Cr⁶⁺的去除率为75%。万俊杰等利用微生物代谢产生的γ-聚谷氨酸絮凝剂对含Cr⁶⁺废水进行Cr⁶⁺去除处理，结果显示，pH为4，30mL30mg/L的废水中添加γ-聚谷氨酸1.5mL和1%CaCl₂2.4mL时，Cr⁶⁺的去除率可达55%。盛姣等通过试验得出微生物发酵米糠对Cr⁶⁺的最佳吸附条件为微生物发酵米糠浓度10g/L、温度60℃、pH2、Cr⁶⁺质量浓度不超过40mg/L、吸附平衡时间40min时，吸附率达95.7%。Valerie等将含Cr泥土与链霉菌在培养基中混合培养，发现当泥土中Cr⁶⁺浓度为1800mg/kg时，经过30d后，去除率达到100%。本研究中筛选出的4株菌株较上述各研究中对Cr的吸附率更高，应用前景更广，可以将这些菌株进行进一步试验研究，探讨温度、pH、初始Cr浓度等因素对其吸附Cr的影响。

关于土壤Cr污染的生物技术治理，国内外学者们已经进行了大量相关研究，筛选出一些重金属Cr吸附菌株，如硫酸盐还原菌、芽孢杆菌属、埃希氏菌属、阴沟杆菌、大肠杆菌、假单胞菌属等。胡勇等从不同来源的样品中分离出吸附Cr⁶⁺较强的菌株X07，经鉴定为蜡状芽孢杆菌（B.CereUS）：周鸣等从污染土壤中分离出地衣芽孢杆菌（B.licheni-formais），利用其死菌体进行Cr6+吸附动力学研究；魏斐等筛选出的去除Cr⁶⁺的菌株经鉴定为苏云金芽孢杆菌（B.mucilaeinosus），本试验中筛选出的菌种均为芽孢杆菌，与前人的研究结果相一致。由此可见，芽孢杆菌属细菌在土壤重金属Cr污染的治理中具有十分广阔的应用前景。