铁皮石斛提取物的抗氧化活性研究

王珂珂 王威 谢倩 陈清西

摘要：比较了4种栽培模式下铁皮石斛提取物的抗氧化活性，为铁皮石斛的栽培进一步开发利用提供理论依据。用煎煮法回流提取了4种栽培模式铁皮石斛，浓缩冻干得到铁皮石斛提取物，以抗坏血酸（Vc）为对照，分别测定了提取物的清除DPPH自由基、羟基自由基（·OH）、超氧阴离子自由基（O-2）能力。结果表明：4种栽培模式下铁皮石斛提取物均具有不同程度的抗氧化活性，且抗氧化活性与提取物质量浓度呈量效关系。林下床栽铁皮石斛提取物的·OH清除活性（IC50值为4.329 mg/mL）在4种栽培模式中最好；林下附生铁皮石斛提取物的DPPH（IC50值为4.494 mg/mL）和O-2（IC50值为2.773 mg/mL）清除能力在4种栽培模式中均最强，且林下附生铁皮石斛提取物的O-2清除活性于对照抗坏血酸（Vc）的IC50值与无显著性差异。结论：铁皮石斛提取物可以抑制抗氧化活性，且林下仿野生栽培铁皮石斛的抗氧化活性优于大棚床栽。

关键词：铁皮石斛；提取物；抗氧化活性

中图分类号：R284

文献标识码：A 文章编号：16749944（2016）09000403

1 引言

生物体内的活性氧自由基，在一般情况下处于平衡状态，但自由基处于辐射或化学物质诱导等情况下，会造成平衡状态的缺失。此时生物体的各种疾病就会出现[1～3]。目前抗氧化剂分为化学合成抗氧化剂和天然食品抗氧化剂，以天然食品为原材料的抗氧化剂因健康、无毒而成为当前抗氧化剂发展的主要趋势[4]。铁皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）是兰科（Orchidaceae）石斛属（Dendrobium）植物，为我国传统名贵中药材，具有药用价值高，市场需求大等特点[5]。但野生铁皮石斛资源早在20世纪80年代已非常稀缺，被列为国家重点保护的濒危药用植物，因此当前铁皮石斛主要来源于人工栽培[6，7]。铁皮石斛人工栽培模式主要分为林下仿野生栽培、大棚设施栽培、盆栽等系列栽培模式[8，9]。同时，不同栽培模式铁皮石斛的生长环境存在一定的差异性[11]，但目前关于铁皮石斛栽培模式与抗氧化活性方面的比较尚未深入研究。因此本试验以4种栽培模式下铁皮石斛为材料制备提取物，研究林下附生、林下床栽、林下悬挂3种仿野生栽培模式与大棚栽培模式下的铁皮石斛提取物体外抗氧化活性的差异，以明确铁皮石斛抗氧化活性的最佳栽培模式，为铁皮石斛的进一步开发利用提供理论依据。

2 材料与方法

2.1 材料、试剂与仪器

2.1.1 材料

试验设在漳州扬基生物科技有限公司的龙眼果场与设施大棚内进行。选择同一来源，同一批次，同一品种的铁皮石斛组培苗，于温室内驯化1年，2013年7月选取长势一致、健康、无病虫害、饱满的铁皮石斛幼苗分别移植于龙眼树下和大棚内，栽培模式详见表1。于2015年3月采收样品，并去除叶片、根和叶鞘，鲜茎置-20 ℃冰箱备用。

2.1.2 试剂

二苯代苦味酰基自由基（DPPH）、邻苯三酚、邻二氮菲，硫酸亚铁、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、H2O2等试剂均为均为国产分析纯。

2.1.3 仪器与设备

TU-1810 紫外可见光分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）；AKWL-IV-50 艾柯超纯水系统（成都康氏康宁科技发展有限公司）；BS214D电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；台式离心机（美国 Kendro 仪器公司）；DK-S24型电热恒温水浴箱（上海景宏试验设备有限公司）；N1001 EYELA 旋转蒸发仪（上海爱朗仪器有限公司）；奥立龙 Model868 型酸度计（北京长风仪器仪表公司）。

2.2 方法

2.2.1 提取物的制备

取铁皮石斛鲜茎，洗净后剪段并精密称量置于500 mL烧杯中，按1∶2（m/V）料液比加入蒸馏水浸泡1 h，加热回流2 h，同样的方法提取2次，合并提取液，离心（3500 r/min，10 min，2次），取上清液减压浓缩，随后真空冷干，置-20 ℃冰箱保存备用。

2.2.2 铁皮石斛抗氧化性的测定

将铁皮石斛提取物及Vc标准品（阳性对照）分别配制成浓度为2、4 mg/mL、6、8、10、12、14、16 mg/mL的样品液，用于抗氧化活性测定。

参照黄琴等[12]的方法测定铁皮石斛提取物对DPPH、·OH自由基清除活性，并计算IC50值（当清除率为50%时的样品浓度）；参照Sarikurkcu C等[13]的方法测定铁皮石斛提取物对O-2自由基清除活性，并计算IC50值（当清除率为50%时的样品浓度）。所有试验平行测定3次。

1.3 数据统计分析

数据采用Excel 2010整理、统计、做图；使用SPSS 17.0对组间数据进行单因素试验分析及处理。

3 结果与分析

3.1 铁皮石斛清除DPPH自由基活性的评价

由图1可知，3种林下仿野生栽培模式在浓度为2～8 mg/mL时，对铁皮石斛提取物清除DPPH自由基能力的趋势线相近；在浓度为8～16 mg/mL时林下附生铁皮石斛提取物清除DPPH自由基能力的上升趋势加快，并大于其他2种林下仿野生栽培模式。同时随着浓度增加，4种栽培模式下铁皮石斛提取物清除DPPH自由基能力与Vc的差距逐渐减小，在16 mg/mL时，铁皮石斛提取物于Vc相近，并接近饱和。其中林下附生铁皮石斛提取物清除DPPH自由基的效果最好，大棚床栽铁皮石斛最差。

3.2 铁皮石斛清除羟基自由基活性的评价

羟自由基是最强的氧化剂之一，在活性氧中其具有化学性质活泼，寿命短，反应强等特点。可以和蛋白质、核酸等发生反应，并损伤生物体，引起癌症等疾病。因此清除·OH是对抗疾病的有效手段之一。

由图2可知，4种栽培模式下的铁皮石斛提取物对·OH有不同程度的清除作用，其清除能力随石斛浓度的增大而增强，呈现显著的量效关系。在浓度为8 mg/mL时，林下附生和林下床栽铁皮石斛提取物显示了较强的清除·OH能力，其清除能力分别达到了83.43%、84.08%， 而林下悬挂和大棚床栽只达到了63.37%和64.03%的清除活性。且林下附生和林下床栽的稳定性比Vc要好，在10 mg/mL时清除能力达到饱和。

3.3 铁皮石斛清除超氧阴离子活性的评价

O-2是生物体内主要的自由基之一，其经过一系列反应后能生成其他的氧自由基，从而引起细胞膜结构及功能的改变。

由图3可知，4种栽培模式下铁皮石斛提取物对O-2均具有促进氧化作用，且随浓度的变化氧化作用不断升高。同时，不同栽培模式下铁皮石斛提取物的氧化效果有一定的差异，林下附生铁皮石斛提取物的氧化效果最好，在8 mg/mL时已接近饱和，其氧化效果等同于Vc对照；林下床栽、林下悬挂和大棚床栽铁皮石斛提取物分别在12 mg/mL、16 mg/mL和16 mg/mL时与Vc对照达到无显著性差异。同时在浓度为2～10 mg/mL时，林下悬挂铁皮石斛提取物的氧化效果高于林下床栽；在浓度为10～16 mg/mL时，林下床栽铁皮石斛提取物的氧化效果高于林下悬挂铁皮石斛提取物。

3.4 抗氧化活性的IC50值

由表2可知，在4种栽培模式下铁皮石斛提取物的清除DPPH、·OH、O-2自由基等抗氧化试验中，铁皮石斛提取物对清除DPPH的IC50从大到小为林下附生>林下床栽>林下悬挂>大棚床栽；对清除·OH的IC50从大到小为林下床栽>林下附生>大棚床栽>林下悬挂；对清除O-2的IC50从大到小为林下附生>林下悬挂>林下床栽>大棚床栽。同时，林下附生铁皮石斛提取物对清除O-2的IC50值与Vc对照无显著性差异。但总的来说，4种栽培模式下铁皮石斛提取物的抗氧化活性要弱于Vc对照。

4 讨论

本试验结果表明，铁皮石斛提取物在一定的浓度下具有较好的抗氧化活性。其中林下附生铁皮石斛提取物的还原性最好，对清除DPPH、O-2自由基的效果最佳，其IC50分别为3.402 mg/mL、4.494 mg/mL、2.773 mg/mL；林下床栽铁皮石斛提取物对清除·OH的效果最好，其IC50为4.329 mg/mL。同时，已有研究表明，铁皮石斛多糖[14]、铁皮石斛花[15]、铁皮石斛极性提取物[16]对DPPH、·OH自由基及还原力等均表现出较强的抗氧化能力，这与本文的结果一致，表明铁皮石斛提取物的抗氧化活性能够替代人工合成的抗氧化剂。

在4种栽培模式下铁皮石斛提取物对体外抗氧化活性研究中，发现林下仿野生栽培铁皮石斛提取物的抗氧化活性优于大棚设施栽培，尤其是林下附生和林下床栽的栽培模式。这可能一方面是林下仿野生栽培模式具有光照充足、通风、透气性好等特点；另一方面龙眼树皮及周围布满大量的苔藓，加强了龙眼树对雨露的截留和长效保持的能力，同时提供铁皮石斛的肥料来源[17]。但大棚床栽的栽培模式，其氧化活性稳定，可能与大棚床栽的地理位置方便，利于定期施肥、喷水管理，而其他3种林下立体栽培模式地处基地，需要来往查探，不便于随时管理。因此对铁皮石斛的栽培如何进一步研究，以提高大棚和林下栽培的铁皮石斛品质具有重要意义。

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