急性心肌梗死患者坏死心肌组织自噬相关基因表达及意义

王韦，张政(上海市青浦区中山医院青浦分院，上海201700)



急性心肌梗死患者坏死心肌组织自噬相关基因表达及意义

王韦，张政(上海市青浦区中山医院青浦分院，上海201700)

摘要：目的观察急性心肌梗死(AMI)患者坏死心肌组织自噬相关基因Beclin1、微管相关蛋白1轻链3(LC3)-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Atg5 mRNA及蛋白表达，探讨其意义。方法选取行冠状动脉介入治疗的AMI患者50例，取其坏死心肌组织为观察组；疑似心源性疾病患者20例，取其正常心肌组织为对照组。采用Real-time PCR和Western blotting法分别检测两组自噬相关基因Beclin1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Atg5 mRNA及蛋白表达，分析各基因相对表达量与AMI患者年龄、性别、心功能分级的关系。结果观察组心肌组织自噬相关基因Beclin1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Atg5 mRNA及蛋白的相对表达量均较对照组升高(P<0.05或<0.01)；随心功能分级增加，上述基因的表达量逐渐升高，随年龄增长表达量逐渐降低。结论AMI患者坏死心肌组织自噬相关基因表达升高，心肌细胞自噬可能参与AMI的发生、发展。

关键词：急性心肌梗死；自噬；自噬相关基因；Beclin 1；微管相关蛋白1

急性心肌梗死(AMI)是心脏病患者致死、致残的主要病因[1,2]，近年来其发病率逐年上升。自噬是一种广泛存在于真核细胞的细胞死亡方式，参与心脏疾病的发生、发展[3]。目前，关于AMI患者是否存在心肌细胞自噬及自噬对病情影响的报道较少。本研究观察AMI患者坏死心肌组织自噬相关基因Beclin 1、微管相关蛋白1轻链3( LC3)-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Atg5 mRNA及蛋白表达，并探讨其意义。

1资料与方法

1.1临床资料选取2009年9月～2012年8月上海市青浦区中山医院青浦分院诊治的AMI患者50例，均符合《中华医学会心血管病学分会2001年急性心肌梗死诊断和治疗指南》的诊断标准[4]，其中男27例，女23例；年龄35～72(51.3±5.8)岁，<41岁4例、41～50岁16例、51～60岁19例、≥61岁11例；心功能Ⅰ级8例，Ⅱ级11例，Ⅲ级22例，Ⅳ级9例；排除生命体征不稳定，心源性休克、先天性心脏病及心肌病等心血管病变，凝血功能障碍，肝、肾等全身其他脏器衰竭，严重感染，糖尿病、低血压、高血压和贫血患者。从症状发生到住院时间均在1周以内；均行冠状动脉介入(PCI)术及常规药物治疗。PCI术中均留取坏死心肌组织作为观察组。选取本院疑似心源性疾病患者20例，均经心内膜取心肌组织活检，经镜下检查未见心肌组织病理改变，即正常心肌组织，作为对照组。

1.2心肌组织Beclin1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Atg5 mRNA检测采用实时定量PCR法。将心肌组织剪碎置于组织研磨钵中，采用TRIzol法提取总RNA，DNase I消化、酚/氯仿抽提及异丙醇沉淀纯化RNA，按照RNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0反转录试剂盒说明书操作获得mRNA，根据SYBR Premix Ex Taq Ⅱ (Tli RNaseH Plus)试剂盒操作说明书配制荧光定量PCR反应体系，于荧光定量PCR仪进行PCR扩增，根据2-ΔΔCt方法计算Beclin1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Atg5 mRNA的相对表达量。分析各基因相对表达量与AMI患者年龄、性别、心功能分级的关系。Beclin1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Atg5和β-actin基因引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成[5]。

1.3心肌组织Beclin1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Atg5蛋白检测采用Western blotting法。采用含有0.1% PMSF的预冷生理盐水冲洗心肌组织，加入400 μL RIPA裂解液于组织研磨器上研磨，冰上静置30 min，4 ℃环境下10 000 r/min离心30 min，取上清液，采用BCA蛋白浓度测定试剂盒检测蛋白浓度。取100 μg蛋白加入4×SDS-PAGE Loading buffer沸水中孵育10 min，进行SDS-PAGE电泳。电泳结束后切下目的蛋白凝胶于转膜仪上转膜，转膜后的膜用含有5%脱脂奶粉的TBST液封闭，分别加入Beclin1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Atg5和β-actin抗体孵育过夜，TBST液洗膜后加入二抗结合1 h，冲洗后利用ECL发光试剂盒显影，于化学发光成像系统观察、拍照，计算Beclin1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Atg5蛋白的相对表达量。分析各基因相对表达量与AMI患者年龄、性别、心功能分级的关系。

2结果

2.1两组Beclin1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ和Atg5 mRNA表达比较观察组Beclin1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Atg5 mRNA及LC3-Ⅱ mRNA/LC3-Ⅰ mRNA相对表达量均较对照组升高(P<0.05或<0.01)。见表1。观察组不同年龄、性别和心功能分级者Beclin1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Atg5 mRNA相对表达量比较见表2。

表1　两组Beclin1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ和Atg5 mRNA表达比较

注：与对照组比较，*P<0.05，△P<0.01。

表2　观察组不同年龄、性别和心功能分级者Beclin1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Atg5 mRNA表达比较

注：与年龄<41岁者比较，*P<0.05，△P<0.01；与心功能分级Ⅰ级者比较，#P<0.05，▲P<0.01。

2.2两组Beclin1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ和Atg5蛋白表达比较观察组Beclin1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Atg5蛋白及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ均高于对照组(P<0.01或<0.05)。见表3。观察组不同年龄、性别和心功能分级者Beclin1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Atg5 蛋白表达见表4。

表3　两组Beclin1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Atg5蛋白表达比较

注：与对照组比较，*P<0.05，△P<0.01。

表4　观察组不同年龄、性别和心功能分级者Beclin1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Atg5蛋白表达比较

注：与年龄<41岁者比较，*P<0.05，△P<0.01；与心功能分级Ⅰ级者比较，#P<0.05，▲P<0.01。

3讨论

自噬是存在于真核细胞生物体内的新陈代谢现象，是细胞的一种自我更新和自我防护机制。适度的自噬可保护细胞免受环境刺激的影响，而自噬过度或自噬缺陷则可导致疾病的发生[6～10]。心肌细胞自噬在许多心血管疾病的发生、发展过程中扮演重要角色[11]。心肌细胞是一种长寿命分裂后期细胞，属于终末细胞，其分化再生能力较弱。Vacek等[12]报道，心肌细胞的长时间存活与自噬密切相关。在生理状态下，心肌细胞自噬水平低，但在保障心脏功能和维持心肌活力方面具有重要作用。心肌细胞通过自噬作用降解错误折叠或功能异常的蛋白质，为心肌细胞提供能量、促进物质循环以维持正常心肌功能；同时自噬亦可清除受损或老化细胞的细胞器，使其不断自我更新。研究证实，心肌缺血可引起心肌细胞营养不足，激发心肌细胞自噬；自噬可选择性增加氧缺乏时ATP的生成以适应这种低营养状态，从而发挥心脏保护作用[13]。通过调节和恢复细胞自噬为前瞻性的抗衰老策略，可改善或缓解多种年龄相关的退行性病变。

自噬的激活受到LC3、Atg和Beclin1等多种自噬相关基因的调控。Beclin1基因也称BECN1基因，是哺乳动物最早发现的自噬基因之一，主要通过与PI3K形成复合体调节自噬活性[14]。当自噬发生时，Beclin1基因活性明显上调。Beclin1能与分隔膜结合，通过募集Atg家族蛋白Atg12-Atg5-Atg16复合物形成前自噬泡。Atg是自噬发生过程中的特异性基因，在自噬的发生和调控过程中发挥重要作用。LC3是与自噬体形成相关的哺乳动物蛋白，LC3具有两个亚型，即胞质型LC3-Ⅰ和膜型LC3-Ⅱ。在自噬泡形成过程中LC3发挥至关重要的作用，自噬激活时LC3前体加工成细胞质可溶性形式LC3-Ⅰ；随后LC3-Ⅰ经酶解迅速成为膜结合形式LC3-Ⅱ并结合于前自噬体和自噬体，促进自噬体外膜的延展扩张；同时Atg12-Atg5-Atg16复合物脱落，形成成熟的自噬体。一旦与溶酶体融合，LC3-Ⅱ即被水解酶降解。

本研究结果显示，观察组自噬相关基因Beclin1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Atg5 mRNA和蛋白表达均显著增高，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ(定量反映细胞自噬活性的指标)也明显高于对照组，说明AMI患者心肌细胞存在明显自噬现象；此外，随年龄增加，AMI患者心肌组织Beclinl、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Atg5 mRNA和蛋白表达及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ值均逐渐降低，与Taneike等[15]报道结果一致。自噬是真核细胞内的一种主要消化降解途径，心肌缺血时自噬活性上升可以清除受损线粒体，增强蛋白质降解，但随着年龄增加，心肌降解蛋白质能力下降，自噬水平降低。本研究中随心功能分级增加，AMI患者心肌组织Beclinl、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Atg5 mRNA和蛋白表达及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ均逐渐增高，可能是由于随着梗死程度加剧，心肌细胞线粒体大量损伤，细胞中产生大量活性氧，增强自噬活性[10]，但其具体机制仍需进一步研究。

综上所述，AMI患者坏死心肌组织自噬相关基因表达升高，心肌细胞自噬可能参与AMI的发生、发展。

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(收稿日期：2015-12-15)

中图分类号：R541.4

文献标志码：B

文章编号：1002-266X(2016)12-0046-03

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2016.12.015

通信作者：张政(E-mail: qpwangwei@126.com)