七氟醚预处理对梗阻性黄疸肝缺血再灌注大鼠肾损伤的影响及机制

张雪霞，李毅，李文华，周少朋(中山大学附属第五医院，广东珠海519000)



七氟醚预处理对梗阻性黄疸肝缺血再灌注大鼠肾损伤的影响及机制

张雪霞，李毅，李文华，周少朋(中山大学附属第五医院，广东珠海519000)

摘要：目的观察七氟醚对梗阻性黄疸肝缺血再灌注大鼠肾损伤的影响，探讨其作用机制。方法将60只SD大鼠随机分成三组，每组20只。模型组制备梗阻性黄疸肝缺血再灌注模型；七氟醚预处理组吸入七氟醚30 min、吸入空气30 min，制备梗阻性黄疸肝缺血再灌注模型；正常对照组仅手术游离肝门至胆总管。分别于处理1、3、6、12、24 h每组随机选取4只大鼠行下腔静脉采血，检测血清肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)。处死大鼠，取左肾组织，光镜下观察肾组织病理学变化；制备肾组织匀浆，检测肾组织丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、三磷酸腺苷(ATP)。结果对照组不同时间点肾小管及肾间质结构正常；模型组肾脏近曲小管上皮细胞浊肿，并出现细胞崩析、广泛细胞管形成；七氟醚预处理组肾组织改变同模型组，但程度均减轻。与对照组比较，模型组及七氟醚预处理组各时间点血清Cr、BUN水平均升高(P均<0.01)；七氟醚预处理组各时间点血清Cr和BUN水平均低于模型组(P<0.05或<0.01)。与对照组比较，模型组及七氟醚预处理组各时间点肾组织MDA升高，SOD、ATP降低，组间比较P均<0.01；七氟醚预处理组各时间点肾组织MDA低于模型组，SOD、ATP高于模型组，组间比较P<0.05或<0.01。结论七氟醚预处理可减轻梗阻性黄疸肝缺血再灌注大鼠肾损伤，其机制可能与减少氧自由基产生有关。

关键词：梗阻性黄疸；缺血再灌注；七氟醚；丙二醇；超氧化物歧化酶；三磷酸腺苷

肝脏缺血再灌注损伤是梗阻性黄疸手术中常见的病理生理过程，其产生原因与原发疾病本身及手术方式等有关，可导致肝脏本身及远隔脏器(如肾脏)的损伤[1～3]。氧化应激和炎症反应是缺血再灌注损伤的主要发病机制。麻醉剂七氟醚具有抗炎特性，但其对缺血再灌注损伤的影响尚不清楚。2014年1月～2015年7月，本研究观察了七氟醚对梗阻性黄疸肝缺血再灌注大鼠肾损伤的影响，现分析结果并探讨其作用机制。

1材料与方法

1.1材料清洁级成年雄性SD大鼠60只，体质量150～200 g，购自中山大学北校区动物实验中心。七氟醚购自美国雅培公司，丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)活力检测试剂盒、三磷酸腺苷(ATP)检测试剂盒、BCA蛋白均购自南京建成生物工程研究所。

1.2动物分组及处理将SD大鼠随机分为三组，每组20只。模型组：制备梗阻性黄疸肝缺血再灌注模型[4]。大鼠术前禁食12 h、禁水2 h，腹腔注射戊巴比妥钠(40 mg/kg)，腹部剃毛、消毒，经剑突下正中切口约2 cm，暴露第一肝门及肝左、中叶肝蒂，用无损伤钳夹闭左侧叶、中央叶的血管和胆管，造成70%肝脏缺血，阻断30 min后取下血管夹，恢复肝脏供血。术后肝组织病理切片及血清肝功能结果均提示造模成功。七氟醚组：将大鼠置于有机玻璃箱内，进气端连接七氟醚挥发罐，挥发罐控制吸入醚的浓度。采用麻醉机的气体流量计控制混合气体流量，出气端连接麻醉气体监测仪，维持七氟醚吸入浓度为2.4%，并在麻醉箱底铺设钠石灰以吸收CO2，持续30 min后吸入空气30 min；制备梗阻性黄疸肝缺血再灌注模型，方法同模型组。正常对照组：仅手术游离肝门至胆总管。分别于处理1、3、6、12、24 h每组随机选取4只大鼠，行下腔静脉采血，于常温下3 000 r/min离心10 min，取血清。取血后处死大鼠，分别取左肾组织，沿矢状面剖开，一半置于10%中性甲醛溶液固定，石蜡包埋，行病理切片；另一半制备组织匀浆，-80 ℃冰箱保存。

1.3相关指标观察①肾组织病理学变化：取肾组织切片，光镜下观察肾组织病理学变化。②肾功能：采用HITACH7170全自动生化分析仪检测血清肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)。③肾组织MDA、SOD、ATP：取肾组织匀浆，采用化学比色法测定肾组织MDA、SOD、ATP，具体操作参照试剂盒说明书。

2结果

2.1各组肾组织病理学变化对照组不同时间点肾小管及肾间质结构正常；模型组肾脏近曲小管上皮细胞浊肿，并出现细胞崩析、广泛细胞管形成，且在缺血再灌注3、6 h较明显，6 h后减轻；七氟醚组肾组织改变同模型组，但改变程度均减轻。

2.2各组不同时间点血清Cr、BUN及肾组织MDA、SOD、ATP水平比较与对照组比较，模型组及七氟醚预处理组各时间点血清Cr、BUN水平均升高(P均<0.01)；七氟醚预处理组各时间点血清Cr和BUN水平均低于模型组(P<0.05或<0.01)。与对照组比较，模型组及七氟醚预处理组各时间点肾组织MDA升高，SOD、ATP降低，组间比较P均<0.01；七氟醚预处理组各时间点肾组织MDA低于模型组，SOD、ATP高于模型组，组间比较P<0.05或<0.01。见表1。

表1　各组不同时间点血清Cr、BUN及肾组织MDA、SOD、ATP水平比较

注：与对照组同时间点比较，#P<0.01；与模型组同时间点比较，△P<0.05，▲P<0.01。

3讨论

对梗阻性黄疸患者行手术治疗时常采用经典的Pringle肝门阻断术或其他肝门阻断术以减少术中出血的风险，但肝门阻断可造成肝脏的缺血再灌注损伤[5]，血流阻断及氧运输减少导致炎症反应并最终损伤器官是其发生的主要原因。肝脏缺血再灌注不仅导致肝脏损伤，还会导致远隔脏器(如肾脏)的损伤[6]。本研究模型组肾小球毛细血管及肾间质充血、肾小管上皮细胞水肿均较其他组严重，血清Cr、BUN水平也较其他组升高，说明肝缺血再灌注后可导致肾组织损伤，与Oliveira-Santos等[7]研究结果一致。

肝缺血再灌注所致肾损伤的发生机制尚未阐明，但普遍认为可能与氧自由基代谢、氧化应激、细胞能量代谢等有关。MDA是反映机体脂质过氧化物含量及受超氧离子自由基攻击程度的常用指标[8]。SOD能清除超氧离子自由基[9]，尤其对缺血再灌注过程中产生的超氧离子自由基的清除作用明显[10]。ATP由线粒体产生，能够反映细胞线粒体的功能状态及细胞能量代谢水平[11]。因此，检测肾组织MDA、SOD和ATP可以间接反映肾组织内自由基水平。有研究表明，七氟醚预处理可明显降低缺氧/复氧后细胞内活性氧及MDA的生成，提示七氟醚通过降低细胞产生的活性氧，恢复抗氧化酶活性，从而减少细胞死亡，抑制低缺氧/复氧所诱发的氧化损伤[12]。

本研究七氟醚组肾脏病理学改变轻于模型组，血清Cr、BUN水平低于模型组，肾组织ATP、SOD水平高于模型组、MDA低于模型组；说明七氟醚预处理可减轻梗阻性黄疸大鼠肝缺血再灌注引起的肾损伤，其机制可能与抑制氧自由基产生有关。但本研究对七氟醚预处理的观察时间仅24 h， 其长期疗效及具体作用机制有待进一步研究。

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(收稿日期：2015-09-14)

中图分类号：R575

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2016)12-0031-03

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2016.12.009

通信作者：周少朋(E-mail: xiaoxuetougao@163.com)

基金项目：珠海市科技计划项目(2014D0401990017)。