红花水煎液对系统性硬皮病小鼠皮肤及肺组织纤维化的影响及机制

梁娟，祁承林，胡谋波，郑雪嘉，吕军影(广西医科大学第一附属医院，南宁530021)



红花水煎液对系统性硬皮病小鼠皮肤及肺组织纤维化的影响及机制

梁娟，祁承林，胡谋波，郑雪嘉，吕军影(广西医科大学第一附属医院，南宁530021)

摘要：目的探讨红花水煎液对系统性硬皮病(SSc)小鼠皮肤及肺组织纤维化的影响及其作用机制。方法32只BALB/C小鼠随机分为空白组、模型组、强的松组、红花组，每组8只。空白组背部注射生理盐水，其余三组均背部注射博来霉素制备SSc模型；造模同时空白组和模型组给予生理盐水0.2 mL/d灌胃，强的松组给予强的松溶液0.2 mL/d(含强的松0.09 mg)灌胃，红花组给予红花水煎液0.2 mL/d(含红花30 mg)灌胃，均连续给予28天。取各组背部注射区皮肤和肺组织行HE和Masson染色，检测真皮厚度；采用样本水解法检测皮肤和肺组织羟脯氨酸(HYP)含量；采用免疫组化法检测皮肤和肺组织IL-17、IL-6表达；ELISA法检测血清IL-17、IL-6水平。结果空白组真皮厚度为(295.90±53.44)μm，模型组为(689.01±157.20)μm，强的松组为(562.58±113.74)μm，红花组为(433.80±83.62)μm，组间比较P均<0.05。与空白组比较，其余三组皮肤和肺组织HYP含量均升高；与模型组比较，强的松组、红花组皮肤和肺组织HYP含量均降低，红花组降低更显著；组间比较P均<0.05。与空白组比较，其余三组皮肤和肺组织IL-17、IL-6表达及血清IL-17、IL-6水平均升高；与模型组比较，强的松组、红花组皮肤和肺组织IL-17、IL-6表达及血清IL-17、IL-6水平均降低，红花组降低更显著；组间比较P均<0.05。结论红花水煎液可改善SSc小鼠皮肤及肺组织纤维化；抑制IL-17、IL-6表达，减轻免疫炎症反应可能是其作用机制之一。

关键词：系统性硬皮病；红花；白细胞介素17；白细胞介素6；BALB/C小鼠

系统性硬化病(SSc)又称硬皮病，是以皮肤和(或)内脏结缔组织局限性或弥漫性纤维化为主要特征的一种自身免疫性疾病，由于其病因和发病机制尚不完全清楚，目前尚无特效疗法。临床主要应用糖皮质激素、免疫抑制剂等治疗SSc，但药物不良反应较多且疗效均不理想[1]。研究表明，活血化瘀类中药红花具有扩张血管、改善血液循环、调节机体免疫功能、抑制成纤维细胞增殖等作用，并可在一定程度上减轻药物不良反应，扶正固本，增强临床疗效[2～5]。2014年11月～2015年11月，本研究观察了红花水煎液对SSc小鼠皮肤及肺组织纤维化的影响，现分析结果并探讨其作用机制。

1材料与方法

1.1材料动物：32只6～8周近交系BALB/C小鼠，SPF级，雌性，体质量18～22 g，购于广西医科大学动物实验中心，动物许可证编号：SCXK桂2014-0002；在室温20～25 ℃、相对湿度50%～70%的清洁环境中分笼饲养，采用12 h昼/夜循环照明。主要药物及试剂：注射用盐酸博来霉素(规格：15 mg/瓶，批号：140372，日本化药株式会社)溶于高压灭菌的0.01 mol/L PBS(pH 7.2)中，制成浓度为200 μg/mL缓冲液，过滤除菌后分装于EP管中，4 ℃保存备用。中药红花(批号：140901，产地：新疆)采用常规方法加水煎煮并浓缩成浓度为1 g/mL的红花水煎液，4 ℃保存备用。强的松片(规格：5 mg/片，批号：141123，广东华南药业集团有限公司)溶于蒸馏水中制成浓度为0.45 mg/mL的混悬液，现配现用。

1.2动物分组及处理随机将32只小鼠分为空白组、模型组、强的松组、红花组，每组8只。按照文献[6,7]方法将所有小鼠剃去背部中央区相同部位被毛，面积约2.0 cm×2.0 cm，以4.5号无菌注射针头在小鼠背部中央被毛区皮下注射，空白组注射0.01 mol/L PBS(pH 7.2)，其余各组均注射浓度为200 μg/mL的注射用盐酸博来霉素缓冲液，0.1 mL/次，1次/d，连续注射28天。造模开始即行药物干预，根据小鼠与人折算系数表，计算小鼠(体质量20 g)使用强的松剂量为0.09 mg/d，红花剂量为30 mg/d。强的松组给予强的松溶液0.2 mL/d(含强的松0.09 mg)灌胃，红花组给予红花水煎液0.2 mL/d(含红花30 mg)灌胃，空白组和模型组给予等容量生理盐水灌胃，均连续给药28天。各组均自由饮水、饮食。用药结束后禁食1天，不禁水。第2天将所有小鼠按2 mL/kg腹腔注射10%水合氯醛麻醉，取眼动脉血收集于未抗凝管内，37 ℃静置30 min，离心取上清，-80 ℃保存。处死小鼠，取背部注射区皮肤及肺组织，一部分放入10%多聚甲醛溶液固定，脱水，石蜡包埋，4 μm厚连续切片；一部分4 ℃保存。

1.3相关指标观察①一般情况：干预过程中观察各组小鼠活动度、反应度、皮肤、毛发等一般情况。②组织病理学变化：取各组皮肤及肺组织切片，进行HE染色和Masson染色，操作步骤参照试剂盒说明书，光学显微镜下观察皮肤及肺组织病理学改变。采用病理图像分析仪系统软件测定真皮厚度，每张切片随机取5处测真皮厚度，取平均值。③皮肤及肺组织羟脯氨酸(HYP)含量：取各组皮肤及肺组织，采用样本水解法检测HYP，具体操作参照试剂盒说明书。以双光束紫外线分光光度计在550 nm波长处测吸光度值(OD值)，并换算为HYP含量(mg/g)。④皮肤和肺组织IL-17、IL-6表达：取各组皮肤及肺组织切片，采用免疫组化SABC法检测IL-17、IL-6，步骤参照试剂盒说明书。IL-17工作液浓度为1∶200、IL-6为1∶200。以PBS代替一抗作为阴性对照。镜下观察结果，采用Olmpus图像采集系统和Image-pro plus6.0图像分析软件进行定量分析，每张切片随机选取5个视野，以细胞质、细胞核内出现棕黄色颗粒为阳性，测定每个视野下染色的平均光密度值(IOD值)。IOD=总OD值/阳性面积。⑤血清IL-17、IL-6水平：取各组血清样本，采用ELISA法检测血清IL-17、IL-6。严格按照说明书操作，以酶标仪在450 nm波长处读取OD值，计算浓度。

2结果

2.1一般情况干预过程中各组均无死亡。空白组一般状态良好，反应灵敏，未见消瘦；背部注射区皮肤有轻度增厚，无硬化现象，表面细腻光滑，毛发光泽、质地柔软、生长迅速。模型组精神差，活动量少，明显消瘦；背部注射区皮肤显著增厚变硬，弹性差，与皮下组织粘连，毛发未见生长。强的松组、红花组皮肤毛发可见不同程度生长，活动度好于模型组，红花组上述改变优于强的松组。

2.2皮肤及肺组织病理学变化HE染色和Masson染色显示，空白组皮肤和肺组织结构完整，无明显炎症细胞浸润。模型组皮肤表皮棘层肥厚，真皮层明显增厚，胶原纤维明显增粗、膨大、数量增多、排列紧密、均质化；真皮下层血管增粗，管壁明显增厚，管腔变小，甚至闭塞，周围可见炎症细胞浸润；皮肤附属器萎缩，减少；肺部结构破坏，肺泡间隔增厚，小血管壁增厚，肺泡内出血，肺间质、肺泡和支气管壁可见纤维性增厚，以淋巴细胞为主的炎症细胞浸润。红花组和强的松组真皮厚度较模型组减轻，胶原纤维稀疏，真皮小血管壁变薄；肺泡壁厚度减小，炎症细胞渗出减少；其中红花组效果更好。空白组真皮厚度为(295.90±53.44)μm，模型组为(689.01±157.20)μm，强的松组为(562.58±113.74)μm，红花组为(433.80±83.62)μm，组间比较P均<0.05。见插页Ⅱ图1、2。

2.3皮肤和肺组织HYP含量与空白组比较，其余三组皮肤和肺组织HYP含量均升高；与模型组比较，强的松组、红花组皮肤和肺组织HYP含量均降低，红花组降低更显著；组间比较P均<0.05。见表1。

表1　各组皮肤和肺组织HYP含量比较±s)

注：组间比较，P均<0.05。

2.4皮肤和肺组织IL-17、IL-6表达与空白组比较，其余三组皮肤和肺组织IL-17、IL-6表达均升高；与模型组比较，强的松组、红花组皮肤和肺组织IL-17、IL-6表达均降低，红花组降低更显著；组间比较P均<0.05。见表2。

表2　各组皮肤和肺组织IL-17、IL-6表达

注：组间比较，P均<0.05。

2.5血清IL-17、IL-6水平与空白组比较，其余三组血清IL-17、IL-6水平均升高；与模型组比较，强的松组、红花组血清IL-17、IL-6水平均降低，红花组降低更显著；组间比较P均<0.05。见表3。

表3　血清IL-17、IL-6水平比较

注：组间比较，P均<0.05。

3讨论

SSc是一种累及多系统的慢性自身免疫性疾病，其发病机制主要涉及三个方面：成纤维细胞活化和纤维化、血管病变、免疫系统异常活化和失调[8]。皮肤和组织器官广泛纤维化、硬化为SSc的主要特征，肺是最常受累的内脏器官。成纤维细胞是参与组织纤维化、硬化的主要细胞，并且是胶原合成的主要场所。免疫系统异常活化和失调在SSc的发生、发展过程中发挥重要作用[9]。

在纤维化组织中T淋巴细胞增多，促进炎症反应，刺激成纤维细胞增殖、胶原增加，引起纤维化[10]。研究发现，在SSc病变早期至皮肤纤维化之前的病变过程中即出现大量T细胞、巨噬细胞及肥大细胞浸润。说明T淋巴细胞活化在SSc发生、发展过程中发挥至关重要的作用[11]。Th17细胞是以表达IL-17为特征的CD4+T细胞亚型，IL-17是其最主要的效应因子，具有强大的致炎作用，可通过诱导活化T细胞、产生多种炎性介质，诱导炎症发生。IL-6是最近几年发现的一种促炎和促纤维化的细胞因子，是T细胞诱导炎症的早期始动因素，与TGF-β联合诱导初始T细胞分化成为Th17细胞，参与自身免疫性疾病的发病；此外，在成纤维细胞中Th17细胞分泌的IL-17又可促进IL-6产生；IL-6、IL-17共同参与刺激成纤维细胞增生，导致组织纤维化[12,13]。

博来霉素是碱性糖肽类抗癌抗生素，是产生活性氧的药物之一，免疫因素可能是其诱导组织纤维化的机制之一。本研究对BALB/C小鼠皮下注射盐酸博来霉素缓冲液，并采用反映组织内胶原含量的Masson染色，同时用水解法测定HYP含量以分析胶原含量，结果显示小鼠皮肤和肺组织炎症细胞浸润、HYP含量增加、真皮厚度增加，提示SSc模型制备成功；皮肤和肺组织IL-17、IL-6表达、血清IL-17、IL-6水平均升高，提示IL-6、IL-17通过诱导分化和活化T淋巴细胞，直接参与皮肤及肺组织的免疫性炎症，促进SSc发生。

目前对SSc的治疗尚无特效药物，糖皮质激素具有免疫抑制作用，是临床上治疗SSc性价比最高的药物之一。SSc的一般治疗方案为强的松30 mg/d，连用数周，逐渐给予维持量5～10 mg/d[14]。但糖皮质激素对SSc的疗效并不十分显著，不宜长期使用，且对于肢端型硬皮病、有肺纤维化和肾损害者禁用。中药红花，又名金红花、草红花、刺红花和怀红花，为菊科植物红花的干燥筒状花冠。中医认为红花味辛、微苦，性温，归心和肝经，具有活血通经、散瘀止痛的功效。红花的化学成分主要包括黄酮类、生物碱类、聚炔类、亚精胺类、木脂素类、倍半萜类、有机酸类、烷基二醇类、多糖类等。黄酮类化合物红花黄色素为红花的主要有效成分[15]。现代药理研究表明，红花的化学成分具有广泛的药理活性，能改善心脑血氧供应、减轻缺血性损伤，抗凝血、抗心肌缺血、抑制血小板聚集。此外，红花还具有镇静、镇痛、抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗纤维化、免疫调节等作用，临床多用于心血管系统疾病、妇科疾病、神经系统、免疫系统等疾病的治疗[16]。

本研究给予SSc小鼠以红花水煎液干预，并选择强的松作为对照药物，结果显示红花组、强的松组 皮肤及肺组织炎症细胞浸润程度均较模型组减轻，真皮厚度、HYP含量均降低，红花组上述指标改善情况均优于强的松组；提示红花水煎液可改善SSc小鼠肺及皮肤纤维化，且效果优于强的松。红花组、强的松组肺及皮肤组织IL-17、IL-6表达及血清IL-17、IL-6水平均较模型组下降，红花组下降更显著；说明两种药物均能通过降低IL-17、IL-6，减轻免疫炎症，进而抑制组织纤维化形成，且红花水煎液效果更好。

综上所述，红花水煎液可改善SSc小鼠肺及皮肤组织纤维化，抑制IL-17、IL-6表达，减轻免疫炎症反应可能是其作用机制之一。

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Effects of safflower decoction on skin and lung fibrosis of mice with systemic scleroderma and its mechanism

LIANGJuan,QIChenglin,HUMoubo,ZHENGXuejia,LYUJunying

(TheFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

Abstract:ObjectiveTo study the effects of safflower decoction on the skin and lung fibrosis of mice with systemic scleroderma (SSc) and its mechanism. MethodsThirty-two BALB/C mice were randomly divided into the blank group, model group, prednisone group and safflower group, 8 mice in each group. The blank group was injected with normal saline, and the other three groups were treated with bleomycin (BLM) at the back to establish the SSc models. At the same time, the blank group and model group were given normal saline (0.2 mL/d), the prednisone group was given prednisone (0.2 mL/d), safflower group was given safflower decoction (0.2 mL/d), and all groups were treated for 28 days. After 28 days, all mice were decapitated and the blood, back skin of the BLM injection part and lungs were collected. The pathological changes were observed by HE and Masson staining. After that, all the tissue slices were taken to measure the dermal thickness, and we detected the hydroxyproline (HYP) content in the skin and lung tissues by sample hydrolysis method. The expression of IL-17 and IL-6 in the skin and lung tissues was detected by immunohistochemisty. The levels of IL-17 and IL-6 in serum was determined by ELISA. ResultsThe dermal thickness was (295.90±53.44) μm in the blank group, (689.01±157.20) μm in the model group, (562.58±113.74) μm in the prednisone group, and (433.80±83.62) μm in the safflower group (all P<0.05). Compared with the blank group, the contents of HYP in the skin and lung tissues of the other three groups were increased; compared with the model group, the contents of HYP in the skin and lung tissues were decreased in the prednisone group and safflower group, and the decrease in the safflower group was more significant, and significant difference was found between groups (all P<0.05). Compared with the blank group, the expression of IL-17 and IL-6 in the skin and lung tissues and the levels of IL-17 and IL-6 in the serum of the other three groups were increased; compared with the model group, the expression of IL-17 and IL-6 in the skin and lung tissues and the levels of IL-17 and IL-6 in the serum were decreased in the prednisone group and safflower group, and the decrease in the safflower group was more significant (all P<0.05). ConclusionsSafflower decoction can improve lung and skin fibrosis in SSc mice. Inhibiting the expression of IL-17 and IL-6, and alleviating immune inflammatory reaction may be one of its mechanisms.

Key words:systemic scleroderma; safflower; interleukin-17; interleukin-6; BALB/C mice

(收稿日期：2015-12-14)

中图分类号：R593.25

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2016)12-0016-04

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2016.12.005

通信作者简介：吕军影(1966-)，女，主任医师，主要研究方向为中西医结合治疗免疫风湿系统疾病。E-mail： lujunying007@163.com

第一作者简介：梁娟(1988-)，女，硕士研究生，主要研究方向为中西医结合治疗免疫风湿系统疾病。E-mail： liangjuanvip2016@163.com

基金项目：广西壮族自治区卫生厅中医药科技专项(GZPT1239)。