非小细胞肺癌组织中DEC1 mRNA、DEC2 mRNA表达及意义

马育华，彭海英，王志蕙，高伟，汪运山(临沂市人民医院，山东临沂7600；临沂市肿瘤医院； 济南市中心医院)



非小细胞肺癌组织中DEC1 mRNA、DEC2 mRNA表达及意义

马育华1，彭海英1，王志蕙2，高伟1，汪运山3(1临沂市人民医院，山东临沂276003；2临沂市肿瘤医院；3 济南市中心医院)

摘要：目的探讨非小细胞肺癌组织中分化型胚胎软骨发育基因1(DEC1)mRNA和DEC2 mRNA表达变化及意义。方法收集42例非小细胞肺癌患者的癌组织标本，28例癌旁正常组织标本；采用实时RT-PCR法检测两种组织标本中DEC1 mRNA、DEC2 mRNA的相对表达量；分析DEC1 mRNA、DEC2 mRNA表达与非小细胞肺癌患者临床病理参数的关系。结果DEC1在非小细胞肺癌组织中相对表达量为0.045 6，正常组织为0.001 7；DEC2 mRNA在非小细胞肺癌组织中的相对表达量为0.056 6，正常组织为0.000 9；两组比较P均<0.05。DEC1 mRNA、DEC2 mRNA表达与非小细胞肺癌患者性别、年龄、肿瘤直径、分化程度和TNM分期均无关(P均>0.05)；DEC1 mRNA、DEC2 mRNA在腺癌中的相对表达量均高于鳞癌(P均<0.05)。非小细胞肺癌组织中DEC1 mRNA、DEC2 mRNA表达呈正相关(r=0.691，P<0.05)。结论非小细胞肺癌组织中DEC1、DEC2过表达，二者的表达变化可能参与非小细胞肺癌的发生和发展。

关键词：非小细胞肺癌；分化型胚胎软骨发育基因1；分化型胚胎软骨发育基因2；相对定量实时RT-PCR

目前，针对细胞信号传导通路中某些蛋白分子的靶向治疗已用于肺癌患者，但治疗效果个体差异较大[1]。分化型胚胎软骨发育基因1(DEC1)和DEC2是细胞信号传导通路中的核转录因子，参与细胞分化、增殖及凋亡[2]。现有研究主要集中于DEC基因在消化道肿瘤中的表达及意义，其与肺癌的关系鲜有报道。此外，目前主要采用免疫组化或Western blotting技术进行DEC1和DEC2表达的检测，但其操作步骤繁琐、所用单克隆抗体来源不同、检测环境存在差异、结果判读主观性较强，导致结论差异较大。本研究采用相对定量实时RT-PCR方法[6]检测非小细胞肺癌组织中DEC1 mRNA、DEC2 mRNA表达，探讨DEC1 mRNA、DEC2 mRNA在非小细胞肺癌发生、发展中的作用。

1资料与方法

1.1临床资料选择2012年12月～2014年12月临沂市肿瘤医院收治的非小细胞肺癌患者42例，男28例，女14例；年龄43～76岁、平均60岁，其中年龄≤60岁 21例、>60岁 21例；肿瘤直径≤3 cm 14例，>3 cm 28例；低分化20例，中高分化22例；腺癌28例，鳞癌14例；T1期17例，T2和T3期25例。42例均手术切取癌组织，28例切取癌旁正常组织(距肿瘤距离>5 cm)。

1.2癌组织及癌旁正常组织DEC1 mRNA及DEC2 mRNA表达检测Gel Doc 1000紫外图像分析系统。抽提组织RNA，通过核酸蛋白测量仪检测抽提RNA的质量和浓度，要求A260/A280在1.8～2.0，并计算RNA含量。合成cDNA，反应体系20 μL，包括总RNA 2 μg、5×gDNA Buffer 2 μL、10×Fast RT Buffer 2 μL、RT Enzyme Mix 1 μL、FQ Primer Mix 2 μL，加RNA free H2O至20 μL。合成的cDNA置于-80 ℃冰箱保存，统一时间进行实时荧光定量PCR。PCR反应体系为50 μL，包括cDNA 2.5 μL、2×SuperReal PreMix Plus 25 μL、上下游引物各1.5 μL，加双蒸水至50 μL。样本DEC1、DEC2、GAPDH均平行检测3个孔。扩增程序：95 ℃预变性15 min，94 ℃变性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共40个循环。引物由上海生工生物工程有限公司合成。 DEC1引物上游为5′-TTGCTTTCCTTCCTCG-CTAC-3′，下游为5′-CACACACACCCTGAATCTGC-3′；DEC2引物上游为5′-GCCTACCGTCCCACAGATTA-3′，下游为5′-TTGGTGTCGTCTCGTTTCAT-3′。GAPDH(内参)引物上游为5′-CAGGAGGCATTGCTGATGAT-3′，下游为5′-GAAGGCTGGGGCTCATTT-3′。在扩增反应后绘制溶解曲线。溶解曲线显示，DEC1、DEC2、GAPDH基因三对引物均扩增出特定单一产物，峰的形状说明反应特异性好，峰值对应的温度与预期产物的Tm一致。定量扩增的“S”型曲线说明反应体系的扩增效率一致。根据扩增的CT值计算ΔCT。ΔCT=CTDEC1或DEC2-CTGAPDH。通过公式2-ΔCT计算靶基因在组织中的相对表达量。分析非小细胞肺癌组织中DEC1 mRNA、DEC2 mRNA表达与临床病理参数的关系及癌组织DEC1 mRNA与DEC2 mRNA表达的关系 。

1.3统计学方法采用SPSS21.0统计软件。计量资料以中位数表示，比较采用非参数检验；相关性分析采用Pearson相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1DEC1 mRNA及DEC2 mRNA表达DEC1在非小细胞肺癌组织中相对表达量为0.045 6，正常组织为0.001 7，两者比较P=0.002。DEC2 mRNA在癌组织中的相对表达量为0.056 6，正常组织为0.000 9，两者比较P=0.028。

2.2DEC1 mRNA、DEC2 mRNA相对表达量与非小细胞肺癌患者临床病理参数的关系DEC1 mRNA、DEC2 mRNA相对表达量与非小细胞肺癌患者性别、年龄、肿瘤直径、组织分化程度和TNM分期均无关(P均>0.05)；DEC1 mRNA、DEC2 mRNA在腺癌组织中的相对表达量均高于鳞癌组织(P均<0.05)。见表1。

表1　　　　DEC1 mRNA、DEC2 mRNA相对表达量与非小细胞

2.3非小细胞肺癌组织DEC1 mRNA与DEC2 mRNA表达的关系非小细胞肺癌组织中DEC1 mRNA和DEC2 mRNA表达呈正相关(r=0.691，P<0.05)。

3讨论

在非小细胞肺癌的发生、发展过程中，细胞的信号传导发挥重要作用。近年来研究较多的细胞信号传导分子主要有蛋白激酶家族和核转录家族，蛋白激酶家族主要是酪氨酸蛋白激酶基因，核转录家族主要是分化型胚胎软骨表达基因；上述基因在多种肿瘤组织中过量表达，导致过量的信号传入细胞及细胞核内，影响细胞生长、增殖和分化。

基因表达的相对定量评估有多种方法，最常用的有扩增效率校正法和CT比较法[4]。前者通过实时PCR扩增效率和CT数值计算出相对比值，即通过S型曲线对实时PCR资料进行分析，计算PCR的扩增效率及扩增基因的估计数[5,6]。后者则假设PCR的扩增效率为1，在靶基因与对照基因扩增效率相同的情况下，直接通过公式2-ΔCT或2-ΔΔCT进行计算。在CT值比较法中，2-ΔCT和2-ΔΔCT方程式的选用应根据不同的研究目的。若检测同一样本经过不同处理方式对靶基因表达的影响可以选用公式2-ΔΔCT；若研究相同靶基因在不同样本中的表达，可以选用2-ΔCT公式。本课题主要研究不同靶基因在癌组织和正常组织中的表达情况，因而采用2-ΔCT公式。

DEC1基因定位于人类染色体3p26[7]，5～7 kb，包括5个外显子和4个内含子，启动子区域包括多个GC盒而非TATA盒，在转录因子数据库中发现其5′端区域有多个转录因子结合位点[8,9]。DEC1与肿瘤的关系十分密切，已经发现在乳腺癌、结肠癌、少突胶质瘤等肿瘤组织中DEC1表达升高，在血液病、结肠、肺腺癌、神经胶质细胞瘤和肾癌细胞系中也检测到DEC1高表达[10～12]。本研究显示，DEC1 mRNA在非小细胞肺癌组织中的表达量是正常组织的26.8倍(0.045 6/0.001 7)。DEC1 mRNA在腺癌组织中的相对表达量高于鳞癌组织，但与患者性别、年龄、肿瘤直径、病理分化程度和TNM分期均无关。Chakrabarti等[13]对不同乳腺组织的研究发现，从正常乳腺组织到原位癌组织、再到浸润性乳腺癌组织，DEC1基因的表达量呈逐渐升高趋势，并与肿瘤细胞的病理分级呈正相关。Zheng等[14]研究发现，DEC1 mRNA和蛋白在胃癌组织中表达上调，并与胃癌分化程度呈负相关。Shi等[15]研究显示，DEC1蛋白在肝细胞癌组织中表达与其临床分级有关，且分化程度低的肿瘤组织DEC1蛋白表达也降低。可以看出，从分子水平到蛋白水平，DEC1在不同肿瘤组织中均呈过量表达，提示DEC1在肿瘤发生、发展过程中发挥重要作用，但在不同组织来源的肿瘤中其表达存在异质性，即相关性的趋势不同。产生异质性的原因可能是DEC1基因在启动区域存在多个转录位点，因而在不同组织中发挥作用的机制可能不同；此外，研究方法或样本例数不同也可造成统计学差异。

DEC2基因定位于人类染色体12p12.1-p11.23[16]，亦属于转录因子，对于其在肿瘤中的作用机制存在不同学说。在某些肿瘤及肿瘤来源的细胞系中，缺氧可以上调DEC2表达[17,18]。Nakamura等[19]通过瞬时转染技术证实，DEC2过表达可抑制人错配修复基因MLH1的功能，即DEC2表达对肿瘤的形成存在正调控。Montagner等[20]对三阴型乳腺癌细胞系的研究证实，DEC2通过与低氧诱导因子(HIF)结合，促进HIF与蛋白酶体的相互作用，从而降解HIF。低氧是实体肿瘤物理微环境的基本特征之一，HIF是低氧环境中的重要调节因子。现有的证据表明，低氧是决定恶性肿瘤预后的重要因素。本研究显示，DEC2 mRNA在非小细胞肺癌组织中的表达是正常组织的62.9倍(0.056 6/0.000 9)。DEC2 mRNA在腺癌组织中的相对表达量高于鳞癌组织，但DEC2 mRNA表达与患者性别、年龄、肿瘤直径、病理分化程度和TNM分期均无关。DEC2 mRNA表达变化与肿瘤的关系需进一步研究。

DEC1和DEC2均是碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)结构的转录因子，二者在bHLH区域和Orange区域分别有97%和52%的相似性。但是，DEC2的C-末端富含丙氨酸和甘氨酸，而DEC1无此特点，这可能是DEC2与DEC1功能不同的原因[15]。DEC1在很多组织中广泛表达，而DEC2比DEC1的表达具有更强的组织依赖性。在心脏、骨骼肌及脑组织中，DEC2 mRNA高表达，而在肺、胎盘、胰腺和肾脏组织中其低表达。提示DEC2和DEC1在肿瘤发生、发展中可能具有不同的生物学行为[15]。本研究中非小细胞肺癌组织中DEC1 mRNA和DEC2 mRNA表达存在正相关，提示一种bHLH转录因子家族分子的表达直接影响另外一种分子的表达，但二者相互作用的机制还不明确。

总之， DEC1 mRNA、DEC2 mRNA在非小细胞肺癌组织中表达升高，二者的过表达可能促进非小细胞肺癌的发生、发展。

参考文献：

[1] Tamura K, Okamoto I, Kashii T, et al. Multicentre prospective phase Ⅱ trial of gefitinib for advanced non-small cell lung cancer with epidermal growth factor receptor mutations: results of the West Japan Thoracic Oncology Group trial (WJTOG0403)[J]. Br J Cancer, 2008,98(5):907-914.

[2] Turley H, Wykoff CC, Troup S, et al.The hypoxia-regulated transcription factor DEC1 (Stra13, SHARP-2) and its expression in human tissues and tumors[J]. J Pathol, 2004,203(3):808-813.

[3] Chen C, Ridzon DA, Broomer AJ, et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR[J]. Nucleic Acids Res, 2005,33(20):179-181.

[4] Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method[J]. Methods, 2001,25(3):402-408.

[5] Liu W, Saint DA. A new quantitative method of real time reverse transcription polymerase chain reaction assay based on simulation of polymerase chain reaction kinetics[J]. Anal Biochem, 2002,302(3):52-59.

[6] Rutledge RG. Sigmoidal curve-fitting redefines quantitative real-time PCR with the prospective of developing automated high-throughput applications[J]. Nucleic Acids Res, 2004,32(22):e178.

[7] Pfaffl MW. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR[J]. Nucleic Acids Res, 2001,29(9):e45.

[8] Antonevich T, Taneja R. Assignment of the human Stra13 gene (STRA13) to chromosome 3p26 by in situ hybridization[J]. Cytogenet Cell Genet, 1999,85(3):254-255.

[9] Teramoto M, Nakamasu K, Noshiro M, et a1.Gene structure and chromosomal location of a human bHLH transcriptional factor DEC1/Stra13/SHARP-2/BHLHB2[J]. J Biochem, 2001,129(3):391-396.

[10] Ivanova A, Liao SY, Lerman MI, et al. STRA13 expression and subcellular localisation in normal and tumour tissues: implications for use as a diagnostic and differentiation marker[J]. J Med Genet, 2005,42(7):565-576.

[11] Shen M, Kawamoto T, Yan W, et al. Molecular characterization of the novel basic helix-loop-helix protein DEC1 expressed in differentitate human embryo chondrocytes-iochem[J]. Biochem Biophys Res Commun, 1997,236(2):294-298.

[12] Ivanova AV, Ivanov SV, Danilkovitch MA, et al. Regulation of STRA13 by the von Hippel-Lindau tumour suppressor protein, hypoxia, and the UBC9/ubiquitin proteasome degradation pathway[J]. J Biol Chem, 2001,276(18):15306-15315.

[13] Chakrabarti J, Turley H, Campo L, et al.The transcription factor DECl (stral3,SHARP2)is associated with the hypoxic response and high tumour grade in human breast cancers[J]. Br J Cancer, 2004,91(5):954-958.

[14] Zheng Y, Jia Y, Wang Y, et al. The hypoxia-regulated transcription factor DEC1 (Stra13,SHARP-2) and its expression in gastric cancer[J]. Omics J Int Biol, 2009,13(4):301-306.

[15] Shi XH, Zheng Y, Sun Q, et al. DEC1 nuclear expression: a marker of differentiation grade in hepatocellular carcinoma[J]. World J Gastro, 2011,17(15):2037-2043.

[16] Fujimoto K,Shen M, Noshiro M,et al. Molecular cloning and characterization of DEC2, a new member of basic helix-loop-helix proteins[J]. Biochem Biophy Res Commun, 2001,280(1):164-171.

[17] Grechez-cassiau A, Panda S, Lacoche S, et al. The transcriptional repressor STRA13 regulates a subset of peripheral circadian outputs[J]. J Biol Chem, 2004,279(2):1141-1150.

[18] Miyazaki K, Kawamoto T, Tanimoto K, et al. Identification of functional hypoxia response elements in the promoter region of the DEC1 and DEC2 genes[J]. J Biol Chem, 2002,277(49):47014-47021.

[19] Nakamura H, Tanimoto K, Hiyama1 K,et al. Human mismatch repair gene, MLH1, is transcriptionally repressed by the hypoxia-inducible transcription factors, DEC1 and DEC2[J]. Oncogene, 2008,27(30):4200-4209.

[20] Montagner M, Enzo E, Forcato M, et al. SHARP1 suppresses breast cancer metastasis by promoting degradation of hypoxia-inducible factors[J]. Nature, 2012,487(7407):380-384.

Expression and clinical significance of DEC1/DEC2 mRNA in non-small-cell lung cancer

MAYuhua1,PENGHaiying,WANGZhihui,GAOWei,WANGYunshan

(1LinyiPeople′sHospital,Linyi276003,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the effects of differentiated embryo-chondrocyte expressed gene 1 (DEC1) and DEC2 mRNA in the occurrence and development of non-small-cell lung cancer (NSCLC). MethodsForty-two cases of cancer tissue samples and 28 cases of adjacent normal tissues were collected from NSCLC patients. The relative expression levels of DEC1 and DEC2 mRNA were detected by real-time RT-PCR. The relationships between DEC1 and DEC2 mRNA and the clinicopathological characters of NSCLC patients were discussed. ResultsThe relative expression of DEC1 mRNA was 0.045 6 in the cancer tissues and 0.001 7 in the normal tissues, the relative expression of DEC2 mRNA in the cancer tissues and normal tissues was respectively 0.056 6 and 0.000 9, and significant difference was found between these two groups (all P<0.05). The expression of DEC1 and DEC2 mRNA in the NSCLC tissues was not related with gender, age, tumor diameter, differentiated degree and TNM stage (all P>0.05). DEC1 and DEC2 mRNA was expressed higher in the adenocarcinoma than that in squamous carcinoma (all P<0.05). DEC1 mRNA was positively correlated with DEC2 mRNA (γ=0.691, P<0.05). ConclusionDEC1 and DEC2 is over expressed in NSCLC tissues and its expression changes may be involved in the occurrence and development of NSCLC.

Key words:non-small-cell lung cancer; differentiated embryo-chondrocyte expressed gene 1; differentiated embryo-chondrocyte expressed gene 2; relative quantitative real-time RT-PCR

(收稿日期：2015-08-28)

中图分类号：R734.2

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2016)12-0020-04

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2016.12.006

通信作者简介：汪运山(1962-)，男，主任医师，主要研究方向为肿瘤免疫。E-mail: sdjnwys@163.com

第一作者简介：马育华(1970-)，女，副主任技师，主要研究方向为免疫及分子生物学。E-mail: ma_yuhua@163.com

基金项目：临沂市科技发展计划项目(201313002)。