厄贝沙坦联合骨化三醇对糖尿病肾病大鼠肾功能及TGF-β1、CTGF表达的影响

徐园园，魏迎凤，卢学超，解其华，翟林云 (南通市第三人民医院，南通226000)



厄贝沙坦联合骨化三醇对糖尿病肾病大鼠肾功能及TGF-β1、CTGF表达的影响

徐园园，魏迎凤，卢学超，解其华，翟林云 (南通市第三人民医院，南通226000)

摘要：目的探讨联合应用厄贝沙坦及骨化三醇对糖尿病肾病(DN)大鼠肾功能及肾组织转化生长因子β1(TGF-β1)、结缔组织生长因子(CTGF)表达的影响。方法将40只雄性大鼠随机分为正常对照组、DN组、厄贝沙坦组、骨化三醇组及联合治疗组各8只。除正常对照组外，其余各组均采用腹腔注射链脲佐菌素的方法建立DN模型。骨化三醇组予骨化三醇溶于0.05 mL花生油，以 0.03 μg/(kg·d)灌胃；厄贝沙坦组予厄贝沙坦50 mg/(kg·d)及等量花生油灌胃；联合治疗组予骨化三醇0.03 μg/(kg·d)及厄贝沙坦50 mg/(kg·d)灌胃。DN组、正常对照组予等量花生油灌胃。各组均连续用药8周。8周后检测各组大鼠24 h尿白蛋白定量(24 h UTP)、血尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)；取肾脏行HE染色，光镜下观察各组肾脏病理学改变；免疫组化法检测各组肾组织TGF-β1、CTGF蛋白的表达。结果与厄贝沙坦组、骨化三醇组相比，联合治疗组24 h UTP、BUN、Scr均降低，肾功能病理改变减轻，肾组织TGF-β1、CTGF蛋白表达降低(P<0.05)。结论厄贝沙坦联合骨化三醇对DN大鼠具有保护肾功能、减轻肾组织纤维化等作用，其机制可能与降低肾组织TGF-β1、CTGF蛋白表达有关。

关键词：糖尿病肾病；厄贝沙坦；骨化三醇；转化生长因子β1；结缔组织生长因子

糖尿病肾病(DN)是糖尿病微血管并发症之一，其发病机制目前尚未完全明确。研究表明，高糖介导的肾素-血管紧张素(RAS)系统过度激活是导致DN进展的主要因素[1]。RAS系统激活可诱导转化生长因子β1(TGF-β1)及其相关因子的过度表达，从而介导肾小球的肥大及纤维化。血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)和血管紧张素受体阻滞剂(ARB)可抑制RAS系统激活，已广泛应用于DN的治疗中。然而，由于ACEI及ARB可使肾素的反馈抑制中断，引起肾素的代偿性增加，降低药物疗效，因此DN的治疗仍有待其他药物的干预[2]。近期研究证实，活性维生素D3可通过多种机制保护肾脏的作用[3]。骨化三醇是一种活性维生素D3。2014年8～12月，我们将厄贝沙坦联合骨化三醇用于治疗DN，观察患者肾功能及肾组织TGF-β1、结缔组织生长因子(CTGF)表达的变化，探讨两组药物联和应用治疗DN的疗效。

1材料与方法

1.1动物及试剂健康雄性SD大鼠40只，清洁级，体质量(260±20)g，由南通大学实验动物中心提供。骨化三醇胶丸购自上海罗氏制药有限公司；厄贝沙坦片购自赛诺菲杭州制药有限公司；链脲佐菌素(STZ)购自美国Sigma公司；兔抗大鼠TGF-β1多克隆抗体购自美国Abcam 公司；兔抗大鼠CTGF多克隆抗体购自美国Abcam 公司；即用型SABC-POD(兔IgG)试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2模型制备及分组大鼠适应性喂养1周后，随机选取32只大鼠，禁食12 h，于左下腹一次性注射STZ 60 mg/kg制备DN模型。72 h后尾静脉取血测定血糖，收集24 h尿量，以血糖浓度≥16.7 mmoL/L、尿量>原尿量150%、24 h尿蛋白排泄率>30 mg为DN造模成功。其余8只作为正常对照组，左下腹注射同体积的枸橼酸钾缓冲液。将DN大鼠随机分为骨化三醇组、厄贝沙坦组、联合治疗组、DN组，每组各8只。骨化三醇组予骨化三醇溶于0.05 mL花生油，以 0.03 μg/(kg·d)灌胃；厄贝沙坦组予厄贝沙坦50 mg/(kg·d)及等量花生油灌胃；联合治疗组予骨化三醇0.03 μg/(kg·d)及厄贝沙坦50 mg/(kg·d)灌胃。DN组、正常对照组予等量花生油灌胃。各组均连续用药8周。

1.3肾功能指标测定

1.3.124 h尿白蛋白定量(24 h UTP)测定于造模后第8周末处死大鼠前1天，禁食不禁水，收集各组24 h尿液，采用双缩脲法测定24 h UTP。

1.3.2动脉血尿素氨(BUN)、血肌酐(Scr)水平检测于造模后第8周末处死大鼠前1天腹主动脉采血，采用全自动多功能生化分析仪测定血BUN、Scr水平。

1.4肾脏病理组织观察于造模后第8周末处死各组大鼠，留取肾组织，4%甲醛固定，石蜡包埋，切片行HE染色，光镜下观察各组肾组织病理改变。

1.5肾组织TGF-β1、CTGF蛋白表达采用免疫组化法。一抗分别为兔抗大鼠TGF-β1多克隆抗体及兔抗大鼠CTGF多克隆抗体，严格按照说明书操作。400倍高倍镜视野下观察阳性细胞表达情况，TGF-β1与CTGF阳性为细胞质呈棕黄色颗粒状。每张切片随机选取10个区域，采用Mias-2000图像分析系统测定阳性细胞的积分光密度。

2结果

2.1各组肾功能指标比较厄贝沙坦组、骨化三醇组、联合治疗组24 h UTP、BUN、Scr均低于DN组(P均<0.05)，联合治疗组24 h UTP、BUN、Scr均低于厄贝沙坦组、骨化三醇组(P均<0.05)。见表1。

表1　各组肾功能指标比较

注：与正常对照组比较，#P<0.05；与DN组比较，*P<0.05；与厄贝沙坦组比较，△P<0.05。

2.2各组肾脏病理改变DN组肾小球体积增大，肾小球系膜基质增宽，系膜扩张，基底膜增厚，肾小球毛细血管腔受压变窄，部分肾小球硬化，并有炎性细胞浸润，肾小管扩张或灶性萎缩，并有大量炎性细胞浸润;骨化三醇组、厄贝沙坦组及联合治疗组大鼠的上述病变均有不同程度的减轻，表现为肾小球体积减小，系膜增生改善，炎性细胞浸润减少，其中以联合治疗组最为明显。

2.3各组肾组织TGF-β1、CTGF蛋白表达情况光镜下，正常对照组大鼠肾组织中有极少量的TGF-β1、CTGF表达，DN组TGF-β1、CTGF在肾小球上皮细胞及系膜区、毛细血管袢、肾小管上皮细胞及间质细胞均有表达，骨化三醇组、厄贝沙坦组及联合治疗组肾组织TGF-β1、CTGF表达均有不同程度减少，其中以联合治疗组最为明显。各组肾组织TGF-β1、CTGF蛋白表达比较见表2。

表2 　　　　各组肾组织TGF-β1、CTGF蛋白表达

注：与正常对照组比较，#P<0.05；与DN组比较，*P<0.05；与厄贝沙坦组比较，△P<0.05。

3讨论

DN早期表现为微量白蛋白尿，如不积极干预，可逐渐进展为严重的蛋白尿，最终导致终末期肾病[4]。DN发病机制复杂，目前尚未阐明，其中RAS系统的激活在肾损伤病变中具有重要作用。DN发生时可激活RAS系统，使血管紧张素Ⅱ增加，诱导TGF-β1的过度表达，导致肾小球肥大、增生，成纤维细胞形成及增殖，增加细胞外基质(ECM)的合成，抑制ECM降解，最终导致肾脏纤维化[5]。

目前，临床上抗RAS系统的药物主要为ACEI和ARB，已广泛应用于DN的临床治疗。这两类药物可减少血管紧张素Ⅱ的产生，降低肾小球内压力，减少细胞外基质的积聚，防止肾小球硬化，延缓肾组织纤维化进展。厄贝沙坦是ARB类药物，可以阻断血管紧张素Ⅱ的作用，降低肾小球内压，改善肾血流动力学，使尿蛋白排泄量下降，从而起到保护肾脏的作用[6]。但抗RAS系统的药物也可引起肾素水平升高，从而限制了药物的治疗效果。虽然抗RAS系统的药物在延缓DN进展方面起到一定的效果，但大部分患者的肾功能仍在以一定的速度不断降低，故延缓DN的进展仍需其他药物的干预。

近年研究发现，活性维生素D3及其类似物除了经典的作用外，对肾小球损伤也有保护作用。国外有学者研究发现，在体外培养大鼠和人的肾脏系膜细胞，在培养液中加入活性维生素D3，结果发现系膜细胞增殖减少，尿蛋白排泄下降[7]。亦有研究发现，使用活性维生素D3干预肾炎大鼠模型，可增加足细胞突质膜上的寡聚体数量，对足细胞起到保护作用，从而减轻肾脏病变[8]。可见，应用活性维生素D3治疗DN大鼠可改善肾小球滤过屏障功能，减轻炎症反应，减少足细胞损伤，降低蛋白尿，并且可以减少TGF-β1等细胞因子表达，从而延缓肾小球硬化[9,10]。本研究发现，厄贝沙坦组、骨化三醇组及联合治疗组24 h UTP、BUN、Scr均降低，且联合治疗组低于厄沙坦组及骨化三醇组，联合治疗组肾脏病理改变均减轻，提示骨化三醇可协同厄贝沙坦更好地发挥减少尿蛋白、减轻肾小球及肾间质纤维化等作用，从而保护肾功能、延缓DN的病变。

TGF-β1是最重要的致纤维化细胞因子[11]。CTGF是近年来发现的致纤维化因子。Tall等[12]研究证实，TGF-β1可诱导CTGF的表达，而CTGF作为TGF-β1发挥生物学活性的下游介质，可介导其发挥促纤维化作用。杨烨等[13]研究发现，TGF-β1表达水平越高，肾脏病变越严重，且活性维生素D3可通过TGF-β1途径保护肾脏。因此，抑制TGF-β1、CTGF被认为是治疗肾脏纤维化疾病的有效方法。本研究结果显示，DN组肾组织TGF-β1、CTGF表达均较正常对照组升高，肾脏病理表现为肾小球肥大、ECM积聚等肾脏纤维化改变，提示DN的发生可能与TGF-β1和CTGF的过度表达诱导肾脏纤维化有关[14]；与厄贝沙坦组、骨化三醇组相比，联合治疗组肾组织TGF-β1、CTGF蛋白表达降低，提示厄贝沙坦与骨化三醇联合治疗可进一步降低TGF-β1、CTGF蛋白的表达，从而延缓肾脏纤维化，改善DN病变的进展。

综上所述，厄贝沙坦联合骨化三醇具有保护肾功能、减轻肾组织纤维化、延缓DN进展等作用，其机制可能与降低肾组织TGF-β1、CTGF蛋白的表达有关。

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(收稿日期：2015-10-26)

中图分类号：R587.1

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2016)14-0033-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.14.011

基金项目：江苏省南通市卫生局青年科研基金项目(WQ2014029)。