两种肝郁脾虚型肠易激综合征动物模型制备方法比较

陈富丽，窦志芳

（山西中医学院，山西太原030024）

两种肝郁脾虚型肠易激综合征动物模型制备方法比较

陈富丽，窦志芳

（山西中医学院，山西太原030024）

目的：比较夹尾激怒结合大黄灌胃法和束缚应激结合番泻叶灌胃法两种肝郁脾虚型肠易激综合征（IBS）动物模型制备方法，旨在建立肝郁脾虚型IBS“病证结合”动物模型。方法：50只大鼠随机分成正常组，模型Ⅰ高、低剂量组，模型Ⅱ高、低剂量组5组，每组雌雄各5只。模型Ⅰ组采取夹尾激怒结合大黄灌胃法制备肝郁脾虚型IBS动物模型。模型Ⅱ组采取束缚应激结合番泻叶灌胃法制备肝郁脾虚型IBS动物模型。比较各组行为学指标，血清中血管活性肠肽（VIP）和5-羟色胺（5-HT）含量，肠黏膜5-HT水平，病理组织学检查远端结肠。结果：血清VIP含量：与正常组比较，模型Ⅱ低、高剂量组（雄）升高；模型Ⅰ高剂量组（雌）、模型Ⅱ低剂量组（雌）降低。血清5-HT含量：与正常组比较，模型Ⅱ低剂量组（雄）升高。模型Ⅰ组和模型Ⅱ组Area及IOD值与正常组比较，差异有统计学意义（P＜0.01）。结肠病理组织学检查结果显示，正常组结肠黏膜可见轻至中度水肿，淋巴细胞及嗜酸性粒细胞轻至中度浸润，模型Ⅰ组和模型Ⅱ组与正常组比较病理变化差异无统计学意义。结论：模型Ⅱ低剂量组（雄）（束缚应激结合低剂量番泻叶灌胃法）为比较合理的肝郁脾虚型IBS动物模型制备方法。

肠易激综合征；肝郁脾虚；动物模型

肠易激综合征（IBS）以腹痛或腹部不适、排便后改善为主要症状，病因及其发病机制极其复杂，国内外对本病的治疗仍处于探讨研究阶段。前期的文献学研究和临床流行病学研究提示肝郁脾虚型为IBS最为常见的证型。“病证结合”动物模型是中医动物实验研究中最为理想的模型，本文选择夹尾激怒结合大黄灌胃法［1］和束缚应激结合番泻叶灌胃法［2］两种方法制备肝郁脾虚型IBS动物模型，并进行比较，找到一种更为合理的肝郁脾虚IBS动物模型制备方法。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 SD大鼠50只，雌雄各半，体重（180±20）g。

1.1.2 试剂与仪器 灌胃器、注射器、长尾票夹、白色线绳、肝素抗凝采血管；中药大黄、番泻叶颗粒剂，由我院附属医院提供；5-羟色胺（5-HT）试剂盒、血管活性肽（VIP）试剂盒、4%多聚甲醛固定液等。

1.2 实验方法

1.2.1 分组 50只大鼠随机分成5组，正常组10只（雌雄各5只）；模型Ⅰ组20只（雌雄各10只），按给药剂量分为低剂量组和高剂量组，每组各10只（雌雄各5只）；模型Ⅱ组20只（雌雄各10只），按给药剂量分为低剂量组和高剂量组，每小组雌雄各5只。分组后正常饲养1 w后称体重。

1.2.2 干预方法 分别对模型Ⅰ组和模型Ⅱ组进行肝郁刺激。模型Ⅰ组每笼5只大鼠均用长尾票夹夹住，攻击大鼠尾巴近端1/3处，注意不损伤皮肤，全笼大鼠暴怒、站立对峙、扭叫撕打，每次激怒30min，1次/d，以不破皮流血为度。10 d后开始大黄灌胃，夹尾1次/d，每次15min，灌胃夹尾同时进行，持续14 d，定期称重。

模型Ⅱ组将大鼠双前肢用白色线绳反捆到背部，后肢自由，限制大鼠用前肢搔抓头面部，但不限制其活动，大鼠也会出现暴躁、激怒、对峙、厮打等。束缚时间40min，连续10 d后开始番泻叶灌胃，灌胃束缚同时进行，持续14 d，定期称重。

1.2.3 给药剂量及方法 模型Ⅰ组进行大黄灌胃，模型Ⅱ组进行番泻叶灌胃，正常组灌入体积相等的生理盐水。根据下列公式计算给药量。

模型Ⅰ组，低剂量组大黄的成人用药量为9 g，高剂量组大黄的成人用药量为12 g，按100 g大鼠灌胃0.5mL计算中药液体积。模型Ⅱ组，低剂量组番泻叶的成人用药量为12 g，高剂量组番泻叶的成人用药量为18 g，按100 g大鼠灌胃1mL计算中药液体积。

1.3 指标观察及检测方法

1.3.1 行为学指标 皮肤毛发，行为状态，活跃程度，情绪反应，兴奋程度，饮食状态，大便性状，体重变化。

1.3.2 血液生化学指标 血清中VIP和5-HT含量：造模结束后第3天，一般状态观察结束后，小鼠腹腔动脉取血，肝素抗凝试管中摇匀，4℃低温高速离心15min（3 000 r/min），取上层血浆于-26℃冰箱冻存，检测前速融。使用大鼠VIP酶联免疫分析（ELISA）试剂盒检测血清中VIP含量；使用大鼠5-HT ELISA试剂盒检测血清中5-HT的含量［3-4］。

1.3.3 肠黏膜5-HT水平检测 采血结束，剖腹分离结肠和直肠段，截取结肠约6 cm，再等分为3个2 cm的结肠段，以生理盐水冲洗，分别置入4%多聚甲醛固定液中，固定24 h后放入自动脱水机中自动脱水，石蜡包埋，连续切片（5μm），备用。

结肠免疫组化染色：石蜡切片微波炉抗原修复操作方法：①石蜡切片常规脱蜡至水，蒸馏水冲洗3次；②用3%H2O2孵育8 min（主要根据实验室温度及其他条件决定），阻断内源性过氧化酶，用蒸馏水洗5 min×3；③PBS冲洗5 min×3；④将切片放入盛有0.01M枸橼酸盐缓冲液pH（6.0±0.1）的容器中，置微波炉内抗原修复10min；⑤取出并在室温自然冷却后用PBS洗5min×3。免疫组化染色步骤：①滴加适当的1∶100稀释兔抗鼠5-HT或NGF多克隆抗体，阴性对照用PBS代替一抗，4℃过夜；②用PBS冲洗3min×3；③滴加二抗工作液，在37℃孵育20min；④用PBS冲洗3min×3；⑤DAB室温显色，光镜下控制反应时间；⑥自来水充分冲洗；⑦苏木素复染；⑧梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。每张完成染色的切片在OIympusDP70光学显微镜高倍镜400倍下观察［5］。

1.3.4 病理组织学（远端结肠）指标检测 取距肛门5～6 cm处远端结肠，用4%多聚甲醛固定液固定。HE染色后，显微镜下观察以下内容：固有层有无中性粒细胞浸润，间质有无水肿［6］。

1.4 统计学方法

实验结果分析、统计图表绘制均采用Graphpad prism 5，统计结果以均数±标准差（±s）表示。

2 结 果

2.1 行为学表现

造模前，各组大鼠活动灵敏自如，皮肤毛发整洁，饮食正常，大便成形，软硬适度，肛周洁净。随着肝郁刺激时间推移，除正常组外，其余各组均不同程度出现对外界刺激较少兴奋，淡漠，偶见烦躁不宁、抓耳乱窜、情绪不稳定、易激怒、易受惊吓，易疲倦（表现为造模刺激时各组大鼠的打斗时间递减），食量递减，毛发凌乱，扎堆，嗜睡，蜷卧。模型Ⅰ组发生鼠吃鼠现象，死亡1只。灌胃1 w后，除模型Ⅰ低剂量组外，其余各组大鼠陆续开始便软、腹泻。各模型组大鼠体质量与正常组大鼠体质量相比均有减轻，但雄性大鼠体质量减轻程度高于雌性，尤以模型Ⅱ组为甚（图1）。从外观看，模型Ⅰ组大鼠肝郁表现稍大于Ⅱ组，但模型Ⅱ组大鼠便软、腹泻情况较为普遍。

图1 各组大鼠不同时间段体质量变化

2.2 各组大鼠血清VIP含量及5-HT含量比较

血清VIP含量：与正常组比较，模型Ⅱ低、高剂量组（雄）升高；模型Ⅰ高剂量组（雌）、模型Ⅱ低剂量组（雌）降低。血清5-HT含量：与正常组比较，模型低剂量Ⅱ组（雄）升高。结果见图2。

图2 各组大鼠血清VIP含量及5-HT含量比较

2.3 肠黏膜中5-HT水平检测

每张切片在高倍镜下随机选取3个视野并拍照，图像选用Image-Pro Plus5.1专业图像分析系统处理，测量每个视野中免疫组化染色阳性的细胞面积（Area）、积分光密度（IOD），计算3张图片的Area、IOD平均值作为此标本的代表值。光镜检查显示，5-HT阳性细胞呈棕黄色或棕褐色，5-HT阳性区主要集中于黏膜层、肌间神经丛及肌层，黏膜下层分布较少。结果见图3。模型Ⅰ组和模型Ⅱ组Area及IOD值与正常组比较，差异有统计学意义（P＜0.01）。结果见表1。

图3 肠黏膜免疫组化图

2.4 远端结肠病理组织学检查

结肠病理组织学检查结果显示，正常组结肠黏膜可见轻至中度水肿，淋巴细胞及嗜酸性粒细胞轻至中度浸润（注：描述仅显示显微镜下所见的异常变化，为大鼠的自发性病变），模型Ⅰ组和模型Ⅱ组与正常组比较病理变化差异无统计学意义。结果见图4。

表1 结肠5-HT阳性细胞蛋白表达Area和IOD值 （xx± ss）

图4 远端结肠病理组织检查

3 讨论

3.1 检测指标对造模的意义

3.1.1 行为学指标对造模的意义 本实验主要探讨建立肝郁脾虚型IBS“病证结合”动物模型的方法，中医辨证主要以病人的主观症状为主，动物模型制备依据中医发病机制，尽量制备出与人体疾病相似的症状和体征。腹泻型IBS的主要行为学特征应该出现明显的拱背（证明有腹痛）、腹泻；肝郁的行为学特征应出现对外界刺激基本较少兴奋，淡漠，偶则烦躁不宁、抓耳乱窜、情绪不稳定、易激怒、易受惊吓等；脾虚的行为学特征应出现体质量减轻、食少纳呆、活动少、易疲劳（打斗时间递减）、扎堆、嗜睡、蜷卧、拱背、毛发枯而蓬乱不泽、肛门污秽等。

3.1.2 血液生化学指标对造模的意义 血清VIP是一种由28个氨基酸组成的肽类物质，分布于肠道全层，对胃肠运动主要起抑制作用。所以血浆VIP含量的升高，应该理解为是肠动力增强后的一种负反馈机制造成。

血清5-HT亦称血清素和肠胺，是一种重要的神经递质和信号分子，在这里主要考虑5-HT在情绪心理和胃肠功能方面的作用机制。胃肠道通过肠神经系统自主协调地完成蠕动、分泌及反射功能，受到刺激后，肠嗜铬细胞释放5-HT，刺激黏膜下传入神经纤维，通过肠神经系统调节局部的兴奋和抑制。5-HT能影响胃肠动力、分泌、内脏感知及精神心理（即肝郁表现），这些因素与IBS的发生有着密切关联。所以5-HT含量升高是IBS的一个重要指标。

3.1.3 分子生物学指标对造模的意义 脑肠肽是指存在于胃肠道内分泌细胞、肠道神经系统及中枢神经系统的肽类激素，是脑肠轴与大脑皮层-神经系统共同分泌的一些神经递质，具有神经递质和内分泌激素的双重身份，同时还承担着人体的免疫作用。5-HT作为一种重要的脑肠肽，调节着胃肠运动、分泌吸收等复杂的功能，并与情绪有关，所以远端结肠黏膜5-HT分子含量升高是IBS的又一个重要指标。

3.1.4 病理组织学指标对造模的意义 腹泻型IBS是功能性腹泻的一种，结肠黏膜不应有明显异常病理损伤。所以肝郁脾虚型IBS模型小鼠结肠黏膜无组织学改变，无充血、水肿，无炎细胞浸润。

3.2 检测指标分析结果

3.2.1 行为学指标分析结果 造模前后，模型组与空白组、模型组之间进行比较，模型组各组大鼠均有不同程度的肝郁脾虚的表现，模型Ⅰ组大鼠肝郁表现稍大于Ⅱ组，但模型Ⅱ组大鼠便软、腹泻情况较为普遍，且模型Ⅱ组雄性体质量减轻极为显著。

3.2.2 血液生化学指标分析结果 从血清VIP和5-HT含量看，二者同时显著性升高的是模型Ⅱ组雄性低剂量组，有报道指出腹泻型IBS患者血浆VIP水平显著高于正常对照组（P＜0.05）［7］；李合国等［8］报道大鼠脾虚腹泻型IBS模型血浆VIP含量显著升高。5-HT在IBS和精神情绪性疾病方面有密切联系这一点似乎已成为业界公认的事实。IBS常伴有抑郁症状，而本实验探讨的就是肝郁脾虚型IBS，所以从这两个指标结果来看，模型Ⅱ组雄性低剂量组似乎是我们要找的理想模型。

3.2.3 分子生物学指标分析结果 结肠中5-HT免疫组化检查结果显示，各模型组的结肠黏膜中5-HT含量明显高于对照组，蛋白表达检测结果显示，各模型组与正常组比较，差异有统计学意义（P＜0.01），但模型各组之间比较差异无统计学意义。有报道肝郁脾虚型IBS肠黏膜及神经丛中5-HT水平明显升高［5］。

3.2.4 病理组织学指标分析结果 从远端结肠病理组织学检查结果看，结肠正常的组织学结构由内向外依次为黏膜层、黏膜下层、肌层、浆膜层，黏膜主要为单层柱状上皮，之间分布着大量的杯状细胞；黏膜下层由致密的不规则的结缔组织构成，含有神经、血管和淋巴结；肌层由内环外纵的肌层构成；浆膜由一层薄的结缔组织构成。结合正常组和两个模型组的结果比较，可认为HE染色后，结肠各层结构及细胞形态无明显病理变化，两个模型组虽可见灶性坏死及出血，但为散发性，可认为模型大鼠结肠未见明显异常病理损伤。所以无论是用大黄还是番泻叶来造模都是较为合适的。

综上所述，从行为学表现来看模型Ⅰ组大鼠肝郁表现稍大于模型Ⅱ组，但模型Ⅱ组大鼠便软、腹泻情况较为普遍。我们认为束缚应激法相对于夹尾激怒法对大鼠刺激力度缓和，所以应延长束缚应激肝郁的刺激时间，这样也符合中医肝郁的病机演变规律，我们认为模型Ⅱ低剂量组（雄）为比较合理的肝郁脾虚型IBS的动物模型。

［1］韩秋艳，吴文尧，王敏.肝郁脾虚证动物模型的建立［J］.贵阳中医学院学报，2001，23（3）：59-61.

［2］张涛，潘峰，徐建军.痛泻要方干预脾虚肝郁型大鼠肠易激综合征的实验研究［J］.中成药，2011，33（4）：687-689.

［3］张建英.痛泻要方对醋酸-电刺激和脾虚腹泻肠易激综合征动物模型作用的实验研究［D］.昆明：云南中医学院，2007.

［4］刘艳霞，赵莹，刘蕾，等.肠易激综合征动物模型的复制与评价［J］.实验动物与比较医学，2012，32（2）：165-169.

［5］朴昭衍，王垂杰.肠易激综合征内脏高敏感性模型大鼠结肠黏膜MC、5-HT与NGF变化的研究［C］.北京：中华中医药学会第二十二届全国脾胃病学术交流会会议论文，2011.

［6］赵迎盼，唐旭东，卞兆祥，等.IBS肝郁脾虚型病证结合大鼠模型的建立与评价的初步研究［J］.中国中西医结合杂志，2013，33（11）：1 507-1 514.

［7］沈骏，诸琦，袁耀宗，等.肠易激综合征患者血浆脑肠肽水平的变化［J］.胃肠病学，2005，10（5）：290-292.

［8］李合国，赵志军，张峰.健脾温中方治疗脾胃虚寒型肠易激综合征实验研究［J］.中国中西医结合消化杂志，2002，10（5）：287-289.

（编辑：翟春涛）

Com parison of two types animal IBS models w ith liver stagnation and sp leen deficiency syndrome induced by differentmethods

Chen Fuli，Dou Zhifang
（Shanxi College of TCM，Taiyuan Shanxi030024）

Objective：To compare and optimize the two types of animal IBS model producing processes with liver stagnation and spleen deficiency syndrome.One is to clip the tail irrigation plus gastric intake of rhubarb and the other one is restraint stress plus gastric intake of senna leaf.Methods：50 rats were random ly divided into blank group，large dosagemodelⅠ，small dosagemodelⅠ，large dosage and small dosagemodelⅡ，groups with 5 females and 5 males in each group.Rats inmodelⅠandmodelⅡwere separately induced for liver stagnation.Rats inmodelⅠwere irrigated by tail clipping plus gastric intake of rhubarb.Rats in modelⅡwere induced by restraintstress plus gastric intake of senna leaf. Compare rats behaviors，serum VIP and 5-HT，intestinalmocosa 5-HT and histopathological examination of distal colon in each group.Results：Compared with blank group，Serum VIP was increased in male rats in small and large dosagemodelⅡgroups，decreased in female rats in large dosage ofmodelⅠgroup and female rats in small dosage ofmodelⅡgroup. Serum 5-HT：increase in male rats in small dosage of modelⅡ group.Area and IOD：in modelⅠandⅡgroups were significantly different（P＜0.01）.Histopathological examination of the colon showed thatmild tomedium swollen intestinal mocos，mild tomedium infiltration of lymphocyteand eosinophile granulocyte in rats from controlled group.Those of rats in modelⅠandⅡgroups were not significantly different compared with controlled group.Conclusion：the optimized IBS animalmodelmightbemale rats of small dosagemodelⅡ.

IBS；liver stagnation and spleen deficiency；animalmodel

R285.5

A

1671-0258（2016）01-0021-04

国家自然科学基金资助项目（81373509）

陈富丽，在读硕士，E-mail：xzyxypxb@163.com

窦志芳，教授，硕士研究生导师，E-mail：dzfrxl@163.com