新疆南疆核桃树腐烂病菌鉴定

郭开发，王 刚，吴彩兰，包亚洲，赵思峰

(新疆绿洲农业病虫害治理与植保资源利用自治区高校重点实验室/石河子大学农学院，新疆石河子　832003)



新疆南疆核桃树腐烂病菌鉴定

郭开发，王 刚，吴彩兰，包亚洲，赵思峰

(新疆绿洲农业病虫害治理与植保资源利用自治区高校重点实验室/石河子大学农学院，新疆石河子832003)

摘要：【目的】 明确新疆南疆核桃腐烂病菌种类。【方法】从南疆3个地方采集核桃腐烂病样10份，采用组织分离法分离获得10个分离物，根据科赫氏法则进行致病性测定，结合形态学观察和18 S rDNA-ITS、β-tubulin两个基因序列分析。【结果】经形态学特征鉴定，菌落形态、分生孢子器、分生孢子与已报道的金黄壳囊孢 Cytospora chrysosperma 一致；从18 S rDNA-ITS、β-tubulin 两个基因序列分析可以得出，18 S rDNA-ITS 序列分析结果与 C.chrysosperma (登录号：KP114125.1)相似性为 99%,β-tubulin序列分析结果与 C.chrysosperma (登录号：KP117038.1) 相似性达到 98%。【结论】新疆南疆核桃树腐烂病菌为金黄壳囊孢 C. chrysosperma。

关键词：核桃；腐烂病；鉴定；金黄壳囊孢

0引 言

【研究意义】核桃(Juglansregia L.)是胡桃科核桃属的重要经济树种，是世界四大干果之一，具有丰富的营养和药用价值[1,2]。目前，新疆核桃种植面积约为 28×104hm2(420万亩)，居全国第 3 位，产量近 24×104t[3]。核桃树腐烂病在新疆发生较为普遍和严重，在一些树龄较大的核桃园一般年份发病率在 50% 左右，严重时可达 90% 以上，该病已成为影响核桃生长发育和产量的主要原因[4-6]。【前人研究进展】Yu等[7]首次报道中国陕西省核桃树腐烂病菌为Neofusicoccumparvum，唐俊煜等[5]依据无性型形态学特征，认为新疆南疆核桃树腐烂病菌为胡桃壳囊孢(Cytosporajuglandis(DC) Sacc)，而马荣等[4]筛选新疆核桃腐烂病生防菌时所用病菌为金黄壳囊孢(C.chrysosperma)。【本研究切入点】采用形态学特征和18 S rDNA-ITS、β-tubulin两个基因序列分析，进一步确定新疆南疆核桃腐烂病菌的种类，为核桃腐烂病的有效防治提供依据。【拟解决的关键问题】进一步确定南疆核桃树腐烂病菌的种类，采集、分离核桃树腐烂病菌，并采用形态学特征结合分子生物学技术鉴定其种类，为核桃腐烂病的有效防治提供依据。

1材料与方法

1.1 材 料

从阿克苏地区阿拉尔市塔里木大学核桃资源圃内采集腐烂病样 4 份；从巴音郭楞蒙古自治州库尔勒市周边采集病样 1 份；从阿克苏地区兵团第一师 3 团采集病样 5 份。共计采集样品 10 份，所采集样品均有典型的黄褐色卷须状分生孢子角(图1A)。图1

1.2方 法

1.2.1病原分离与纯化

采用常规组织分离法[8]分离病原菌。在 PDA 平板上进行分离，待分离物长出后，在WA 平板上进行单孢纯化，将纯化后获得的菌株保存在 PDA 斜面上，置 4℃ 冰箱中储存备用。

1.2 .2致病性测定

采用离体枝条接种法[9]进行致病性测定。选取 2 年生健康的核桃树枝条，截成20 cm 长的小段，自来水冲洗后用 0.1% HgCl2浸泡 1 min, 然后用无菌水冲洗、晾干，枝条顶端用保鲜膜将保湿脱脂棉包裹。用烧热的铁钉钉帽(直径 7 mm)烫伤树皮，以菌丝块( 7 mm)作为接种体，在接种部位上方 1～2 cm 处加一块湿的脱脂棉，用保鲜膜将其和接种体同时包扎。每个分离物接种5 个枝条。每个枝条上接种 2 块，随机选取 1 个伤口，以无菌 PDA 饼为空白对照。于 7 d 后观察、记录枝条发病情况，并对发病枝条进行再分离。

1.2.3病原鉴定1.2.3.1形态学鉴定

供试菌株接种在离体核桃枝条上，待其产生产孢体后，挑取产孢体，用双面刀片直接切片，制成玻片后在生物显微镜下观察纵、横切面形态特征并测量分生孢子大小，记录并拍照[10,11]。

1.2.3.2分子鉴定

依据形态学鉴定结果，挑选ALE-2、3-10、3-12和KEL-6这4株代表菌株在 PDA 平板上培养 5 d后，采用Lee等[12]的方法提取菌丝基因组DNA。借鉴Peever 等[13]的方法，用通用引物ITS1和ITS4扩增代表菌株的ITS和5.8 S rDNA，用引物Beta-2a和Beta-2b扩增代表菌株的β-tubulin 基因。PCR反应体系：PCRTaqMix 12.5 L、10 mol/L ITS1/ Beta-2a 1 L、10 mol/L ITS4/ Beta-2b 1 L、基因组 DNA 0.5 L、ddH2O 10 L至终体积为 25 L。ITS 基因 PCR 扩增反应程序为94 ℃ 预变性 4 min，然后94 ℃变性30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸40 s，共30个循环，最后72℃延伸 10 min；β-tubulin基因 PCR 扩增反应程序为：94 ℃预变性 4 min，然后94 ℃变性 30 s，58 ℃退火 30 s，72℃延伸 40 s，共 30个循环，最后 72℃延伸 10 min。反应完成后，1% 琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 反应产物。

将不同引物的PCR 反应产物进一步纯化后委托北京六合华大基因科技股份有限公司进行测序。测序后的序列经校正后，在核酸序列数据库 GenBank 中进行同源序列搜索( BLAST搜索)，比较测试菌株同现有数据库中相应序列的同源程度。用 MEGA5 软件进行比对并构建系统树，应用自展法(bootstrap) 检验系统树，自展数据集为 1 000 次。

2结果与分析

2.1 病原菌的致病性

人工接种 2 年生健康的核桃枝条后，10 个分离菌株均可导致核桃枝条发病。接种 7 d 后接种部位出现褐色、水浸状病斑。随后病斑纵向横向扩展至绕枝条一周。枝条病斑部位表皮皱缩，病健交界明显(图1B)。接种 15 d后，病斑表面产生大量黑色小点，室温干燥条件下产孢体孔口会溢出黄色分生孢子角，对发病组织进行再分离，均可获得相应的接种菌株。对照枝条上未出现症状。图1

注：A,核桃腐烂病症状；B,离体接种后发病的核桃枝条

Note：A, Disease symptoms of canker ofJuglans; B, Valsa canker symptoms on stems after inoculation in vitro

图1核桃树腐烂病症状及致病性测定结果
Fig.1 Disease symptoms and pathogenicity test of valsa canker ofJuglans

2.2形态鉴定

病菌菌落较紧密，菌落白色至乳白色，菌落背面米黄色。培养后期褐色产孢体随机在菌落分布(图2A，2B)。子座埋生在树皮中，突出，褐色，圆形至椭圆形，直径 1.5～1.9 mm；孔口 1 个，黑色，与顶盘同高；分生孢子器由大量内陷的小腔室组成，共用壁，内陷不规则排列呈迷宫状；分生孢子透明、香蕉形，(3.5～5.0)m×(0.9～1.4)m(图3A,B,C)，依据形态特征将病原菌鉴定为C.chrysosperma。图2，图3

图2C.chrysosperma在PDA培养基上菌落特征
Fig. 2Colonycharacteristicsof isolates on PDA

注：A：分生孢子器纵切；B：分生孢子器横切；C：分生孢子

Note：A-B:longitudinal and tangitial section through pycnidia; C.conidiospore

图3C.chrysosperma形态特征
Fig.3Morphologic characteristics ofC.chrysosperma

2.3分子鉴定

分离菌株的 DNA 提取后经电泳检测，所得 DNA 片段约为2 000 bp。利用ITS和β-tubulin两个基因对该病原菌进行 PCR 扩增，经电泳检测分别获得一条大小约为 550 bp 和 500 bp 的清晰条带，将所测得的序列登陆 NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih. gov/blast)进行 Blast 比对，4 个代表菌株的rDNA ITS序列( 登录号分别KT428021.1，KT590421.1，KT428023.1，KT428029.1)与已登录的菌株C.chrysosperma(KP114125) 相似性达到99% ，4 个代表菌株的β-tubulin基因(登录号分别KT428033.1，KT590411.1，KT428034.1，KT428040.1)与已登录的菌株C.chrysosperma(KP117038) 相似性达到98%。通过MEGA5 进行系统发育分析，通过最大简约法构建系统发育树，4 株代表菌株和C.chrysosperma(登录号：EU622277，KJ739480，KF498689， KF498682)处于同一个分枝上，相似性较高。图4～6

目前关于核桃树腐烂病病原菌报道的种类较多。Haggag等[14]依据形态学特征和 ITS 序列分析，鉴定埃及核桃腐烂病原物为Botryodiplodiatheobromae。而 Montecchio 等[15]研究认为在欧洲核桃腐烂病是由真菌Geosmithiamorbida及昆虫Pityophthorusjuglandis共同危害所致。刘振坤等[16]依据形态学特征将新疆核桃树腐烂病菌鉴定为胡桃壳囊孢(C.juglandis)。唐俊煜等[5]对新疆南疆 9 种林木腐烂病菌形态学比较后，认为病原菌也为胡桃壳囊孢 (C.juglandis)。研究依据形态学特征鉴定，18 S rDNA-ITS 和 β-tubulin 基因序列分析，明确了引起新疆南疆核桃腐烂病的病原菌为金黄壳囊孢(C.chrysosperma)，这与马荣等[4]研究结果一致。

注：A,ITS序列；B,β-tubulin基因

图4 核桃腐烂病菌代表菌株PCR扩增结果
Fig.4PCR products of rDNA-ITS,β-tubulin ofCytosporachrysosperma

图5 代表菌株基于 ITS 序列构建的系统发育树
Fig.5 Phylogram using ITS sequences data

图6 代表菌株基于β-tubulin 序列构建的系统发育树Fig.6Phylogram using β-tubulin sequences data

3讨 论

金黄壳囊孢(C.chrysosperma)除危害核桃外，还可危害杨树、柳树、桉树等多种林木树种，在西北、华北及东北地区是危害杨树生产的主要病原因子[17]。杨明秀等[18]从各地杨树、柳树、核桃等多种寄主均可分离得到C.chrysosperma，且致病性与寄主有关，即在杨树上分离的菌对杨树的致病性强于非杨树寄主，但与地理位置无明显关系。

腐烂病已成为新疆林木的主要病害之一，在新疆喀什地区、和田地区核桃树腐烂病发生严重，个别重病园发病率达 70%～90%，严重者整园死亡，已对南疆核桃生产和发展造成严重威胁[4]。研究明确了新疆南疆核桃树腐烂病的病原菌种类，将为核桃树腐烂病的防治提供一定的指导。

4结 论

从新疆南疆采集核桃腐烂病样10份，分离得到10株分离物，经致病性测定、形态学特征、18S rDNA-ITS、β-tubulin 两个基因序列分析，明确南疆核桃树腐烂病病原菌是金黄壳囊孢(C.chrysosperma)。

金黄壳囊孢(C.chrysosperma)与新疆已报道的新疆杨、箭杆杨、胡杨、柳树等树木上的腐烂病菌为一个种[20]。致病性测定结果也表明，该菌既可侵染核桃树，也可侵染新疆杨、箭杆杨、胡杨、柳树等树木，表明金黄壳囊孢(C.chrysosperma)有广泛的寄主范围，可危害新疆多种林木寄主，但该病原菌在几种林木上能否传播以及不同寄主来源的病菌是否存在致病性差异还有待于进一步研究。

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Identification of Canker Pathogen ofJuglansin Southern Xinjiang

GUO Kai-fa，WANG Gang，WU Cai-lan，BAO Ya-zhou，ZHAO Si-feng

(CollegeofAgronomy,ShiheziUniversity/KeyLaboratoryforOasisAgriculturalPestManagementandPlantResourceUtilizationatUniversitiesofXinjiangUygurAutonomousRegion,ShiheziXinjiang832003,China)

Abstract：【Objective】 To isolate and identify canker pathogen of Juglans in Xinjiang.【Method】 A total of 10 canker samples in Juglans were collected and 10 isolates were obtained by tissue isolation, and pathogenicity was determinaed according to Koch's rule. These isolates were identified by means of the morphological features of culture, 18S rDNA-ITS and β-tubulin gene sequences analysis.【Result】Through colony morphology, pycnidium, conidia of the isolates was consistent with the reported Cytospora chrysosperma. ITS identification showed the sequence was up to 99% identical with C. chrysosperma (KP114125.1), β-tubulin identification showed the sequence was up to 98% identical with C. chrysosperma ( KP117038.1).【Conclusion】These isolates from Xinjiang were identified as C. chrysosperma.

Key words:Juglans；Valsa canker；identification ；Cytospora chrysosperma

中图分类号：S436.64

文献标识码：A

文章编号：1001-4330(2016)03-0496-06

作者简介:郭开发(1985-)，男，甘肃武威人，博士研究生，研究方向为植物菌物病害及其防治，(E-mail)andygkf@126.com通讯作者:赵思峰(1975-)，男，四川巴中人，教授，博士，研究方向为生物农药,(E-mail)Zhsf_agr@shzu.edu.cn

基金项目:新疆生产建设兵团青年科技创新资金专项“新疆主要林木腐烂病菌种类鉴定及其关键防治技术研究”(2014CB002)

收稿日期：2015-12-19

doi:10.6048/j.issn.1001-4330.2016.03.015

Fund project:Supported by Youth Science and Technology Innovation Funds of Xinjiang Production and Construction Corps "Species Identification and Key Prevention Technology of Forest Canker in Xinjiang"(2014CB002).