不同发育阶段棉纤维中木质素的沉积变化

胡文冉，范 玲，谢丽霞，王乐乐

(1.新疆农业科学院核技术生物技术研究所，乌鲁木齐　830091；2. 新疆农业大学农学院，乌鲁木齐　830052;

3.新疆农业大学科学技术学院，乌鲁木齐　830052)



不同发育阶段棉纤维中木质素的沉积变化

胡文冉1，范 玲1，谢丽霞2，王乐乐3

(1.新疆农业科学院核技术生物技术研究所，乌鲁木齐830091；2. 新疆农业大学农学院，乌鲁木齐830052;

3.新疆农业大学科学技术学院，乌鲁木齐830052)

摘要：【目的】研究棉纤维不同发育阶段木质素的沉积变化，为纤维品质改良提供理论依据。【方法】利用硫酸法分析棉纤维中木质素的含量，结合组织化学染色法观察木质素在棉纤维中的沉积。【结果】发育20 DPA时单位重量棉纤维中硫酸木质素的积累速率最大，随着棉纤维的发育，单位重量棉纤维中硫酸木质素的积累速率呈下降趋势，成熟后纤维中硫酸木质素积累速率最低；单位重量的棉纤维在发育20 DPA时染色最深，随着纤维的发育，染色越来越浅，与酸性木质素含量积累速率的测定结果相一致。根据组织化学染色结果推测棉花纤维中可能存在G、S两种木质素单体。【结论】在发育20 DPA时相同重量的棉纤维中木质素的沉积速率最大，随着纤维发育木质素的沉积速率越来越低。

关键词：棉纤维；木质素；组织化学染色

0引 言

【研究意义】棉纤维是单细胞结构，其细胞壁的结构物质生化组分含量直接关系棉纤维的产量、品质及其利用。明确棉纤维的结构物质生化组分对于了解棉纤维的品质形成机理具有重要的意义。苯丙烷类化合物可能对棉纤维细胞壁的性质、纤维细胞的生长发育有着重要影响。了解棉纤维不同发育阶段苯丙烷类化合物的动态积累变化对于明确苯丙烷类化合物在棉纤维发育过程中的作用具有重要的意义。【前人研究进展】随着研究手段的不断改进，近年来的部分研究发现并报道了发育中的棉纤维存在着包括苯丙烷代谢途径的细胞次生壁发育的代谢途径[1-7]，而且是棉纤维发育中仅次于纤维素代谢途径的第二大代谢途径[4]，其上扬表达与棉纤维次生壁发育同步[6]。Fan等[7]通过多种分析手段都表明，棉纤维中含有苯丙烷代谢产物-苯丙烷类化合物，苯丙烷代谢和棉纤维细胞壁发育密切相关，苯丙烷代谢产物和棉纤维品质的形成密切相关，并被得到进一步的验证[8]。在自然界中苯丙烷类化合物是仅次于碳水化合物的碳源，包括木质素、木聚素、羟基肉桂酸共轭物、黄酮类化合物、木栓质、角质等[9-11]，与细胞壁的纤维素与半纤维素相连接。形成植物细胞壁内交联结构的苯丙烷类化合物可分为两组：(1) 通过氧化连接形成木质素的单体木质素；(2) 交联于细胞壁上不同化合物的低分子的羟基肉桂酸[12-14]。木质素是由苯丙烷类结构单元(phenylpropane unit)通过 C-C 键(1/3-1/4)和醚键(2/3-3/4)连接形成的交联的无定型三维聚合物。木质素结构单元包括对羟基苯丙烷(p-hydroxyl phenyl propane, H)、愈疮木基丙烷(guaiacyl propane, G)、紫丁香基丙烷(syringyl propane, S) 3种[15]，这三种单体在植物体内通过多种键型连接在一起，形成复杂的木质素聚合体。【本研究切入点】苯丙烷类化合物可能对棉纤维细胞壁的性质、纤维细胞的生长发育有着重要影响。因此，了解棉纤维不同发育阶段苯丙烷类化合物的动态积累变化对于明确苯丙烷类化合物在棉纤维发育过程中的作用具有重要的意义。【拟解决的关键问题】利用硫酸法分析陆地棉TM-1不同发育阶段棉纤维中木质素的含量的动态积累，结合组织化学染色法研究木质素在棉纤维发育过程中的沉积，为棉纤维的品质改良奠定基础。

1材料与方法

1.1材 料

1.1.1陆地棉

陆地棉TM-1种植于新疆农业科学院玛纳斯试验站，在盛花期开花当天挂牌标记，并以此为基点，分别取20、30、40、50 DPA (Day Postanthesis)棉铃，在每株棉花外围果枝中部选取中等大小、果形端正、无病虫害、无机械损伤的棉铃各5个，去除棉壳等，存储于-20oC冰箱中备用；同时取自然成熟棉铃，存储于室温备用。

1.1.2主要试剂

H-buffer (50 mmol/L Tris-HCl, 10 g/L Triton X-100, 1 mol/L NaCl; pH 8.3)；间苯三酚；高锰酸钾；氨水；盐酸；酒精；水为蒸馏水。

1.2方 法

1.2.1获得不同发育阶段棉纤维

从-20oC冰箱取出前期存放的去壳棉铃，置于均一化缓冲溶液中浸泡，用镊子将棉纤维与棉籽分离，注意分离的纤维不可带有种皮等杂质。将分离的棉纤维浸泡在均一化缓冲溶液中，避免产生棉酚褐化现象，并立即进行清洗。对于脱水成熟棉纤维用小型的轧花机脱籽后回收纤维备用。

1.2.2 清洗不同发育阶段棉纤维

棉纤维分别用均一化缓冲液清洗两次，80%丙酮洗两次，纯丙酮洗一次[16]，每次都用金属夹蒜器将纤维中的溶液挤干。之后将洗好的棉纤维置于滤纸上，45oC烘干备用。

1.2.3木质素含量

硫酸法测定不同发育阶段TM-1棉纤维中Klason木质素的含量[17,18]。

1.2.4 组织化学染色1.2.4.1 Wiesner染色[19]

分别称取0.01 g清洗干燥后不同发育阶段的棉纤维置于2 mL离心管中，加0.5 mL浓盐酸，混匀放置10 min后，分别滴加1 M NaOH溶液至中性，倒去反应液，用蒸馏水清洗棉纤维3次，再向离心管中分别加1 mL 5% 间苯三酚溶液(95%酒精配制)，染色10 min后拍照。

1.2.4.2 Mäule染色[20-22]

分别称取0.01 g清洗干燥后不同发育阶段的棉纤维置于2 mL离心管中，加1 mL 1%高锰酸钾溶液，混匀后染色5 min，用蒸馏水冲洗 3 遍后在3% HCl 中浸泡 1 min，蒸馏水洗涤后加1 mL 29% 氨水，放置10 min后拍照。

同时分别称取0.01 g清洗干燥后不同发育阶段的棉纤维置于2 mL离心管中，加1 mL 蒸馏水将棉纤维完全浸润后作为对照。

2 结果与分析

2.1 不同发育阶段棉花纤维中硫酸木质素含量的沉积动态

研究表明，发育20 DPA时单位重量棉纤维中硫酸木质素的积累速率最大，随着棉纤维的发育，单位重量棉纤维中硫酸木质素的积累速率呈下降趋势，成熟后纤维中硫酸木质素积累速率最慢。图1

图1 TM-1不同发育阶段纤维中硫酸木质素积累变化
Fig.1 Dynamic changes of the Klason lignin deposition during cotton fiber developmental stages

2.2 不同发育阶段棉花纤维组织化学染色

研究表明，Wiesner染色时间苯三酚将棉花纤维染成红色，间苯三酚对愈创木基(G) 和紫丁香基(S)木质素产生颜色反应，由此推测棉花纤维中可能存在S和G两种结构单元。研究表明，在发育20 DPA时相同重量的棉花纤维中愈创木基(G) 和紫丁香基(S)木质素已在棉纤维中沉积(图2：6～10)，随着纤维发育红色越来越浅，直至纤维成熟后染色颜色最浅，说明随着棉纤维的发育，在相同重量的棉纤维中愈创木基(G) 和紫丁香基(S)木质素的积累速率越来越少。在Mäule反应中高锰酸钾可以将棉纤维染成棕色(图2：11～15)，推测棉纤维中含有紫丁香基(S)结构单元。在发育20 DPA时相同重量的棉花纤维中紫丁香基(S)木质素已在棉纤维中沉积，随着纤维发育棕色越来越浅，直至纤维成熟后染色颜色最浅，也说明在相同重量的棉纤维中随着棉纤维的发育，纤维中紫丁香基(S)木质素的积累速率越来越少。两种染色结果显示随着棉纤维的发育，纤维中木质素的变化趋势和棉纤维发育过程中硫

注：离心管1～5号分别是未染色的发育20, 30, 40, 50 DPA和自然成熟的棉纤维(CK)；离心管6～10号分别是间苯三酚染色后的发育20, 30, 40, 50 DPA和自然成熟的棉纤维；离心管11～15号分别是高锰酸钾染色后的发育20, 30, 40, 50 DPA和自然成熟的棉纤维

Note: 1-5 showed respectively undyed 20, 30, 40, 50 DPA and mature cotton fiber (CK); 6-10 showed 20, 30, 40, 50 DPA and mature cotton fiber dyed by phloroglucinol; 11-15 showed 20, 30, 40, 50 DPA and mature cotton fiber dyed by potassium permanganate

图2 发育过程中棉纤维组织化学染色
Fig.2 Histochemical staining of cotton fiber in development

酸木质素的测定结果相吻合。根据组织化学染色结果可以推测出棉花纤维中可能存在着愈创木基(G)和紫丁香基(S)两种木质素单体。图2

3讨 论

分析植物细胞壁中木质素含量的方法很多，其中硫酸法提取植物细胞壁中的木质素原理是硫酸将木质素以外的成分溶解除去，木质素作为不溶性成分被过滤分离出来，得到的木质素即为硫酸木质素，也叫Klason木质素。研究表明该方法得到的棉纤维中的硫酸木质素与棉纤维品质中的长度和比强度呈负相关关系，并且该方法测定程序简单，精确度较高[23]，所以常用来衡量棉花纤维中的木质素含量。20 DPA时木质素沉积速率最大，随着纤维发育木质素沉积速率越来越小。与棉纤维发育过程中硫酸木质素含量的测定结果一致[18]。

组织化学染色是检测木质素分布的一种简单有效的方法，染色包括Wiesner和Mäule两个反应，其中Wiesner反应中间苯三酚在酸性条件下可以与木质素中的肉桂醛基团发生显色反应，使其变成红色或粉红色化合物[19]；Mäule反应中由于紫丁香基中游离的酚羟基的存在，染色剂高锰酸钾与酚羟基反应成紫红色或棕色，可以有效地鉴别S基木质素的存在[20-22]。根据实验对棉纤维进行组织化学染色结果推测棉纤维中可能存在着愈创木基(G)和紫丁香基(S)木质素，和棉花茎秆中存在的木质素单体类似[24]。对不同发育阶段棉纤维的染色结果表明20 DPA时木质素沉积速率最大，随着纤维发育木质素沉积速率越来越小。染色结果和棉纤维发育过程中硫酸木质素沉积速率的测定结果相吻合。

棉纤维是由胚珠外珠被的一部分单个表皮细胞在受精前后经分化突起、伸长、次生壁增厚和脱水成熟而形成的[25]。其中棉纤维次生壁的合成与增厚开始于16～19 DPA。该时期棉纤维细胞壁中通过一系列生理生化代谢形成次生壁物质。纤维素也在该时期以结晶态形式每天向内淀积一层。实验结果表明在纤维发育20 DPA时木质素也已在棉纤维中沉积，并且木质素的沉积速率在纤维发育20 DPA时纤维中较高，随着棉花纤维的发育木质素的沉积速率减少。但单个棉铃纤维质量是构成皮棉产量的基础，是体现棉花库质量最直观的指标[26]。棉纤维次生壁发育初始期单个棉铃中木质素与纤维素间的比例相对较高，随着次生壁发育，纤维素快速积累，木质素的积累速度远低于纤维素的积累速度，从而导致相同重量棉纤维中木质素的含量出现降低趋势，事实上，随着单位棉铃的重量增加，单位棉铃纤维中纤维素、木质素的积累量也在逐渐增加，与棉纤维次生壁的发育趋势一致。有研究表明单铃中纤维素的积累[26-28]和木质素的积累[18]都符合“S” 型曲线。

4结 论

发育20 DPA时相同重量棉纤维中硫酸木质素的积累速率最大，随着棉纤维的发育，相同重量棉纤维中硫酸木质素的积累速率呈下降趋势，成熟后纤维中硫酸木质素积累速率最慢。发育20 DPA时相同重量的棉纤维染色最深，随着棉纤维的发育，相同重量棉纤维染色越来越浅，直至纤维成熟后染色颜色最浅。说明相同重量棉纤维20 DPA时木质素积累速率最大，随着棉纤维发育而下降，根据组织化学染色结果推测棉纤维中可能存在G、S两种木质素单体。

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Dynamic Changes of Lignin Deposition during Cotton Fiber Development Stage

HU Wen-ran1, FAN Ling1, XIE Li-xia2, WANG Le-le2

(1.ResearchInstituteofNuclearandBiotechnologies,XinjiangAcademyofAgriculturalSciences,Urumqi830091,China; 2.CollegeofAgronomy,XinjiangAgriculturalUniversity,Urumqi830052; 3.CollegeofScienceandTechnology,XinjiangAgriculturalUnicersity,Urumqi830052)

Abstract：【Objective】 To study the changes of lignin deposition during different developmental stages of cotton fiber and provide a theoretical basis for improving fiber quality. 【Method】In this study, the content of lignin was analyzed by Klason method and lignin deposition observed by histochemical staining. 【Result】The accumulation rate of Klason lignin was the largest per unit weight of cotton fiber at 20 DPA (Day Postanthesis), the accumulation rate showed a decreasing trend with the development of cotton fiber and mature fiber with the slowest rate. The result of histochemical staining showed the deepest color dyeing as the per unit weight of cotton fiber at 20 DPA and the color became shallow with the development of cotton fiber, which was in consistent with the result of the accumulation rate of Klason lignin. Presumably, there may be G (guaiacyl propane) and S (syringyl propane) lignin monomer existing in cotton fiber according to the results of the histochemical staining. 【Conclusion】The deposition rate was the highest when the same weight of cotton fiber in the development of 20 DPA and the rate of lignin in same weight of cotton fiber became less with the cotton fiber development.

Key words:cotton fiber; lignin; histochemical staining

中图分类号：S562；Q946

文献标识码：A

文章编号：1001-4330(2016)03-0467-06

作者简介:胡文冉(1974-)，女，河南人，副研究员，研究方向为棉纤维品质生化机理，(E-mail)huwran@126.com通讯作者:范玲(1958-)，女，新疆人，研究员，研究方向为棉花纤维分子机理与改良，(E-mail)fanlin@xaas.ac.cn

基金项目:自治区创新人才项目“陆地棉和海岛棉纤维不同发育阶段细胞壁超微结构和苯丙烷类化合物的比较”(2014721025)

收稿日期：2015-07-20

doi:10.6048/j.issn.1001-4330.2016.03.011

Fund project:The Talents Engaging in Scientific and Technological Innovations of Xinjiang, China “Comparison of cell wall ultrastructure and phenylpropanoid compounds in developing fibers of upland cotton and sea-island cotton”(No. 2014721025)