利用响应面法优化海洋微生物发酵产角鲨烯的研究*

王晓龙， 谭延振， 候路宽， 崔　球,4， 宋晓金, 李文利,**

(1.中国海洋大学海洋药物教育部重点实验室,医药学院,山东 青岛 266003；

2.青岛市单细胞油脂工程实验室，山东 青岛 266101；

3.中国科学院青岛生物能源与过程研究所，山东省能源生物遗传资源重点实验室，山东 青岛 266101；

4.中国科学院青岛生物能源与过程研究所，中国科学院生物燃料重点实验室，山东 青岛 266101)



利用响应面法优化海洋微生物发酵产角鲨烯的研究*

王晓龙1， 谭延振2,3， 候路宽1， 崔球2,3,4， 宋晓金2,3, 李文利1,**

(1.中国海洋大学海洋药物教育部重点实验室,医药学院,山东 青岛 266003；

2.青岛市单细胞油脂工程实验室，山东 青岛 266101；

3.中国科学院青岛生物能源与过程研究所，山东省能源生物遗传资源重点实验室，山东 青岛 266101；

4.中国科学院青岛生物能源与过程研究所，中国科学院生物燃料重点实验室，山东 青岛 266101)

摘要：采用响应面法对海洋微生物Pseudozyma sp. SD301发酵产角鲨烯培养条件进行优化。在单因素实验结果的基础上，通过Design-Expert软件对葡萄糖浓度、接种量、培养温度、装液量进行4因素响应面实验设计，以角鲨烯产量为响应值，优化菌株Pseudozyma sp. SD301的培养条件，并验证响应面预测值与实测值的一致性。结果表明，在葡萄糖浓度为67.2 g·L(-1)、接种量为1.5%、培养温度为26℃、装液量在41 mL/250 mL的最优培养条件下，角鲨烯产量为1.152 g·L(-1)，比出发条件提高了3.62倍，实测值与响应面预测值吻合良好。

关键词:角鲨烯；发酵优化；Plackett-Burman；响应面优化

引用格式：王晓龙， 谭延振， 候路宽， 等.利用响应面法优化海洋微生物发酵产角鲨烯的研究[J]. 中国海洋大学(自然科学版)， 2016, 46(4)： 89-95.

WANG Xiao-Long, TAN Yan-Zhen, HOU Lu-Kuan, et al.Optimization of fermentation conditions for squalene production by marine microbe using response surface methodology[J]. Periodical of Ocean University of China, 2016, 46(4): 89-95.

角鲨烯(Squalene)是一种脂质不皂化物，其化学名称为2, 6, 10, 15, 19, 23-六甲基-2, 6, 10, 14, 18, 22-二十四碳六烯，属开链三萜。具有增强机体免疫能力、改善机体功能、抗衰老、抗疲劳、抗肿瘤等多种生理功能[1]，是一种无毒性的具有防病治病作用的海洋生物活性物质，并广泛应用于医药、美容、化妆品、食品等各个领域[2]。

角鲨烯拥有广阔的应用前景，然而稀缺的来源极大地限制了其大规模生产和普及使用。目前深海鲨鱼是市场获取角鲨烯的主要途径[3]。但是深海鲨鱼是珍贵的海洋保护生物，大量捕杀会破坏海洋生态平衡，而且从鲨鱼肝油中提取角鲨烯存在高成本及安全卫生问题。从植物获取角鲨烯虽然来源广泛，但是植物中角鲨烯含量低，而且植物产量深受季节和地域的影响[4]。总之天然来源角鲨烯已经远远不能满足日益增长的市场需求和质量要求，工业化生产角鲨烯势在必行。目前来说化学合成方法都存在不同程度的问题，不是歩骤过多、反应复杂；就是反应条件苛刻，条件实现难度大，化学合成角鲨烯目前仅限于实验室的研究，实现工业化合成尚有距离[5]。所以解决角鲨烯来源的瓶颈问题，急需从微生物及其他方向上寻求突破[6]。

利用微生物发酵生产角鲨烯具有无可比拟的优势。利用微生物生产角鲨烯产品质量优质、生产周期短、不受时间地域限制、生产工艺操作简单、安全卫生，是工业生产角鲨烯的最佳选择。因而利用微生物发酵获取优质而廉价角鲨烯成为国际研究的热点。其中破囊壶菌、微藻、酵母及类酵母是目前研究的重点。据报道在光合自养的条件下，一些微藻可以积累一定量的角鲨烯[7]，异养微藻Thraustochytrid也可以具有较高的角鲨烯含量，达到1.2mg·g-1[8]。菌株Aurantiochytriumsp.18W-13a是分离于日本冲绳的高产角鲨烯菌株，其产量可高达(1.29±0.13)g·L-1，是目前已知的角鲨烯产量最高菌株[9]。Elias Englund等[10]研究结果表明Synechocystissp.PCC 6803可以高效积累角鲨烯，拓宽了角鲨烯微生物来源的研究范围。众所周知基因工程改造是提高微生物产角鲨烯能力的重要手段。Garaiová M等[11]通过基因工程手段显著改变酿酒酵母产角鲨烯能力，突显出基因工程在改良菌株方面的强大优势。Akinori Katabami等[12]人通过在EscherichiaColi中表达角鲨烯合酶，实现了角鲨烯在大肠杆菌中的表达，角鲨烯达到230mg·L-1。酵母及类酵母是本领域内已知的产角鲨烯量高的微生物，酿酒酵母、毕赤酵母、有孢圆酵母生产角鲨烯已被广泛研究。Pseudozymasp.JCC207是一株分离自美国近海的类酵母菌株，实验证实其可以高效生产角鲨烯，在优化条件下角鲨烯产量达到340.52mg·L-1，显示出其巨大的工业潜力[13]。

研究室前期分离获得一株可以产角鲨烯的类酵母菌株。利用Plackett-Burman与响应面方法优化其产角鲨烯的发酵条件，建立其高产角鲨烯的工艺方法。采用Plackett-Burman法可以通过较少的试验次数，快速准确地从众多变量间筛选出对响应值有显著效应的因素，有效减少试验考察因素及试验次数。响应面方法(Response Surface Methodology, RSM)是一种在微生物发酵领域有广泛应用的优化方法，其可以形象直接的显示最优区域及最优点。本实验采用响应面方法确定重要因素的最佳水平，利用Design expert软件分析实验数据，得出回归模型和最佳发酵条件，并进行实验验证。最终得到利用Pseudozymasp. SD301发酵产角鲨烯的最佳发酵条件，为海洋微生物产角鲨烯工业化生产提供基础。

1材料与方法

1.1 实验材料及培养条件

Pseudozymasp. SD301菌株由中国科学院青岛生物能源与过程研究所代谢物组学团队研究室分离获得，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号为CGMCC No. 9687。种子培养基：葡萄糖20 g·L-1，酵母抽提物20 g·L-1，海水晶15 g·L-1；固体培养基加入琼脂粉20 g·L-1。发酵培养基为葡萄糖60 g·L-1，酵母抽提物20 g·L-1，海水晶15 g·L-1。

菌株划线于固体平板，25℃培养2d，接种于装有一定体积的种子培养基的250mL摇瓶中，在25℃，200r·min-1的摇床培养一定时间后，种子液按一定比例接种至装有一定体积的发酵培养基的250mL摇瓶中，于选定温度及转速的摇床上培养一定时间后，取发酵液30mL，4000g离心10min，收集菌体，菌体进行冷冻干燥称重并分析角鲨烯含量。

1.2 角鲨烯的提取

角鲨烯的提取参照He[14]等的方法。将菌体磨碎后称取适量菌体(约60 mg)，加入300μL 6mol·L-1HCl，室温放置30 min，沸水浴5 min。冷却后的溶液中加入900 μL氯仿甲醇(2∶1, v/v)，涡旋振荡混匀，12000r·min-1离心5 min，收集下层液体，加入等体积饱和氯化钠，离心取下相。旋转蒸发除去溶剂，50℃真空干燥，得到油脂。加入2mol·L-1NaOH溶液，85℃反应1h，使油脂中的脂肪酸完全皂化。冷却至室温，加入适量饱和NaCl溶液和正己烷，振荡并静置分层。上相用0.22μm滤膜过滤，进行气相色谱分析。

1.3 角鲨烯含量分析

气相色谱条件为：采用Agilent 7890B气相色谱，色谱柱型号为HP-5柱(30m×0.25mm×0.25μm)；载气为高纯氮气，恒流模式，流速1.0mL·min-1；进样体积为1μL，检测器为氢离子火焰检测器。升温程序为：初温100℃，以15℃·min-1升至300℃，保持6min。

角鲨烯(99%，J&K Scientific LTD)溶于色谱级正己烷，做响应峰面积-角鲨烯含量标准曲线(见图1)。根据待测样品中角鲨烯的响应峰面积测定角鲨烯含量。

图1　角鲨烯浓度与峰面积标准曲线图

角鲨烯产量计算公式：

Y=X×Z-1×M×0.03。

其中:Y为角鲨烯产量，单位 g·L-1；X为根据标准曲线得到的角鲨烯质量，单位g；Z为研磨后称取的菌体干重，单位g；M为每次取样(30mL)中菌体干重，单位g；0.03，为常数，表示每次取样的体积，L。

1.4 实验设计

1.4.1 Plackett-Burman实验设计Plackett-Burman实验设计参照Plackett的方法[15-16]。根据前期预实验结果，确定影响角鲨烯发酵的可能因素，对各个因素进行全面考察，实验设计中把每个因素设计成高(+1)和低(-1)2个水平。

1.4.2 中心组合实验中心组合实验参照Adinarayana等的方法[17-19]。采用中心组合设计(Central composite design, CCD)，对PB实验筛选到的关键因子进一步研究，以获得影响该菌发酵产角鲨烯的优化发酵条件。自变量按下式进行编码变换：

Xi=(x-x0)/Δxi，i=1, 2, 3, …, K。

(1)

式中：Xi为自变量xi的编码值，x0为自变量Xi在中心点的值，Δxi为自变量变化步长。用标准多项式回归方法，对实验数据进行拟合，便得到一个二次多项式，该方程为描述响应量(应变量)自变量关系的经验模型。对于2因子系统，模型可描述为:

(2)

式中：Y为预测响应值；β0为截距；βi为线性系数；βii为平方系数；βij为交互作用系数。

2结果与分析

2.1 影响角鲨烯发酵的重要因素

根据前期预实验结果，确定影响角鲨烯发酵的可能因素包括葡萄糖浓度、酵母抽提物浓度、培养时间、初始pH、培养温度、接种量、转速、装液量、瓶型9个因素。为了对各个因素进行全面考察，设计进行了Plackett-Burman实验。实验设计中把每个因素设计成高(+1)和低(-1)2个水平。实验设计见表1。

表1　N=12的Plackett-Burman实验设计与结果

注：各符号表示含义X1，葡萄糖含量(g·L-1)；X2，酵母抽提物含量(g·L-1)；X3，培养时间(day)；X4，培养基初始pH值；X5，培养温度(℃)；X6，初始接种量(%，V/V)；X7，转速(rpm)；X8，装液量(mL)；X9,瓶型。X1，Glucose concention(g·L-1);X2，Yeast extract concention(g·L-1); X3，Culture time(day); X4， Initial pH; X5， Culture temperature; X6， Inocultion quantity; X7， Rotate speed; X8， Loding; X9, Bottle type.

按表1设计进行2轮重复实验，每轮设置3个平行。实验结果取6次平均值，见表1中角鲨烯含量一栏。利用Design expert软件进行分析各因素效益及重要性评价(见表2)。

对角鲨烯发酵过程有显著影响(可信度大于75%，P<0.25)的因素包括葡萄糖含量、接种量、装液量、培养温度。其中葡萄糖、接种量、装液量呈现正效应，培养温度呈现副效应。葡萄糖、接种量对角鲨烯发酵具呈现正效应显著影响，这是因为角鲨烯属于胞内产物，其生物量能够直接显著影响其产物产量。同样，在温度超过其最适温度后，高温对其产生不良影响，抑制菌体生长，所以表现出负效应显著影响。而装液量能够影响角鲨烯产量的原因可能是过少的装液量造成过高的溶氧，使得胞内碳流向能量代谢等途径转移，最终影响角鲨烯产量。其余因素如初始pH值和培养时间对角鲨烯产量没有显著影响，说明本研究中使用的菌株具有良好低pH耐受性和生长迅速的特点，适合工业化生产。

综合Plackett-Burman实验结果可看出，要提高产角鲨烯产量，应该适当提高葡萄糖浓度、装液量和初始接种量，降低培养温度。各个因素最优值有待于进一步实验考察。

2.2 响应面实验优化发酵条件

2.2.1 模型的建立及分析按照数理统计的原理及分析的方法，参照Plackett-Burman实验结果，选取影响最显著的4个因素，葡萄糖、接种量、装液量、培养温度作为研究因素，每个因素选取3个水平，以角鲨烯产量做为评价指标，按照二次项回归方程进行拟合，进行中心组合实验。变量及每个水平对应值见表3。中心组合及其实验结果见表4。

表2　各因素的主要效应

表 3　中心组合实验中变量及其水平

注：各符号表示含义X1，葡萄糖含量(g·L-1)；X5，培养温度(℃)；X6，初始接种量(%，V/V)；X8，装液量(mL)。X1，Glucose concention(g·L-1); X5， Culture temperature(℃); X6， Inocultion quantity(%,v/v); X8， Loding(mL).

2.2.2 多元二次回归方程的建立及显著性检验应用Design-Expert V8.0.6软件进行多元回归拟合[20-21]对中心组合实验数据进行分析，可得葡萄糖(X1)、培养温度(X5)、接种量(X6)、装液量(X8)与响应值角鲨烯产量(Y)的关系，其方程式为：

Y=0.12X1+0.047X5+0.0083X6+0.061X8+0.018X1X5+0.013X1X6-0.071X1X8-0.021X5X6-0.005X5X8-0.00199X6X8-0.12X12-0.18X52-0.086X62-0.13X82

回归方差分析见表5，结果表明：模型决定系数R2=0.9678，葡萄糖(X1)、培养温度(X5)、接种量(X6)、装液量(X8)与响应值角鲨烯产量(Y)存在线性关系；F值为7.03(P<0.0005)，说明此模型高度显著。因素葡萄糖(X1)对角鲨烯产量效应显著，培养温度(X5)、装液量(X8)次之，接种量(X6)几乎无影响;因素X1与X5对角鲨烯发酵交互作用显著，而其他因素两两交互影响不显著。

2.2.3 响应面分析及最优发酵条件的确定及验证借助Design expert软件依据回归方程来绘制响应面立体分析图，考察所拟合的相应曲面的形状响应面立体图如图2所示。利用该组图可以对影响角鲨烯的发酵条件中2种因素的交互效应进行分析和评价，并确定最佳因素水平范围。

图2A显示葡萄糖和培养温度之间交互影响的响应面图。在本实验水平范围内，角鲨烯产量会随着葡萄糖的浓度和培养温度的取值水平而变化。当葡萄糖的浓度小于67g·L-1时，角鲨烯产量随葡萄糖浓度升高而升高，当葡萄糖的浓度大于67g·L-1时，无论培养温度为多少，角鲨烯产量都不会达到最大值。因此葡萄糖浓度应该控制在60～70g·L-1之间。培养温度变化趋势与葡萄糖浓度相似，比较适宜的培养温度在24～28℃之间。

图2B培养温度与装液量对角鲨烯产量的影响。由图可见，培养温度及装液量的变化对角鲨烯产量影响非常明显。前期随着培养温度的升高，角鲨烯产量不断增加，到达峰值25℃时，随着培养温度的升高，角鲨烯产量逐渐减少；与之类似，前期随着装液量的增加，角鲨烯产量不断增加，到达峰值约40mL时，随着装液量的升高，角鲨烯产量逐渐减少。因此，培养温度在24～28℃，装液量在40～45mL之间时，角鲨烯产量最高。

图2C显示葡萄糖与装液量之间交互影响效应的响应面图。由图可见，在角鲨烯产量达到峰值前，葡萄糖浓度及装液量的变化对角鲨烯产量影响非常明显。随着葡萄糖浓度的增加，角鲨烯产量不断增加；装液量增加，角鲨烯产量提高。但当葡萄糖浓度达到约67g·L-1后，增加葡萄糖浓度不能提高角鲨烯产量；与之相对，当装液量在约40mL后，增加装液量会使角鲨烯产量略微减少。因此，控制葡萄糖浓度在60～70g·L-1，装液量在40～45mL之间时，角鲨烯产量最高。

表4　中心组合实验设计及结果

注：各符号表示含义X1，葡萄糖含量(g·L-1)；X5，培养温度(℃)；X6，初始接种量(%，V/V)；X8，装液量(mL)。X1，Glucose concention(g·L-1); X5， Culture temperature(℃); X6， Inocultion quantity(%,v/v); X8， Loding(mL).

表5　角鲨烯二次多项模型的方差分析表

(A.葡萄糖与培养温度对角鲨烯产量的影响；B.培养温度与装液量对角鲨烯产量的影响；C.葡萄糖与装液量对角鲨烯产量的影响；D.葡萄糖与接种量对角鲨烯产量的影响。The effects on Squalene yield by different factorsa A.Glucose concentration and culture temperature; B.Temperature and loadings; C.Glucose concentration and loadings; D.Glucose concentation and inoculation quantity.)

图22种因素的交互效应进行分析和评价

Fig.2The interaction effects of two factors

图2D显示葡萄糖与接种量之间响应曲面图。由此图可知，葡萄糖及接种量的变化对角鲨烯产量影响明显。前期随着葡萄糖浓度的升高，角鲨烯产量不断增加，到达峰值67 g·L-1时，随着葡萄糖浓度升高，角鲨烯产量略微减少；与之类似，前期随着接种量的增加，角鲨烯产量不断增加，到达1.5%时，随着接种量的增加，角鲨烯产量逐渐减少。因此葡萄糖浓度在60～70 g·L-1，接种量比例在1.4%～1.6%之间时，角鲨烯产量最高。

综上所述，低水平或高水平的影响因素都不利于角鲨烯产量的提高，当葡萄糖浓度在60～70 g·L-1，培养温度在24～28℃，接种量比例在1.4%～1.6%之间，装液量在40～45 mL/250 mL，角鲨烯产量最高。当浓度过高或过低时，都会导致角鲨烯产量下降。

从图2中可直观地看出各因子对响应值的影响变化趋势，并且回归模型存在最大值。在葡萄糖浓度为67.2 g·L-1、接种量为1.5%、培养温度为26℃、装液量在41 mL/250 mL的最优培养条件下角鲨烯产量理论最大值可达1.1508 g·L-1。为了检验模型预测的准确性，在优化的条件下进行发酵实验，所得角鲨烯产量为1.1520 g·L-1，这与响应面模型预测结果十分接近，可见该模型能较好地预测实际发酵情况。

3讨论

角鲨烯即三十碳六烯，属于脂质不皂化物，具有众多重要的生理活性。目前，角鲨烯多从鲨鱼肝脏提取。日益严重的环境污染使其难以保证质量安全，同时，大量捕捞鲨鱼也会造成资源枯竭，加剧生态破坏。利用微生物发酵生产角鲨烯，既可以避免质量不可控的风险，也能保护生态资源，因此，微生物生产角鲨烯越来越受到研究者的关注。微生物发酵生产角鲨烯不仅可以解决角鲨烯来源问题，产生巨大的经济效益；同时推动角鲨烯的普及，产生良好的社会效应。与此同时，间接保护深海鲨鱼，维护海洋生态平衡。目前，微生物发酵工艺日益成熟，角鲨烯生产菌株开发突飞猛进，微生物发酵生产角鲨烯前景广阔。

本研究室前期从近海淤泥中分离筛选获得了一株可以产角鲨烯的类酵母。本文就是在此基础上，对该类酵母的培养条件进行优化，以期获得发酵生产角鲨烯优化工艺。前期实验表明，培养基成分中的葡萄糖浓度和酵母抽提物浓度；发酵培养中的初始pH、培养温度、摇床转速、装液量、接种量、瓶型和培养时间都会对角鲨烯的产量产生影响。为了确定以上九个因素对角鲨烯发酵生产的影响开展了本研究。首先采用Plackett-Burman实验，筛选出来影响角鲨烯生产的显著因素。其中，酵母抽提物、初始pH值、瓶型、转速、培养时间影响均不显著。瓶型和转速是通过溶氧影响角鲨烯合成途径和生物量，在本研究条件下，可能是发酵过程对溶氧需求不高，造成以上两个条件影响不显著；初始pH值影响不显著，说明菌株具有较为广泛的pH适应性；酵母抽提物影响不显著，而葡萄糖影响显著，说明生物量能显著影响角鲨烯产量，但碳氮比对角鲨烯产量影响有限；Pseudozymasp. SD301菌株在培养4～6天时一直处于稳定期，发酵体系的代谢水平处于稳定状态，所以对角鲨烯的总生产量影响不显著。

通过响应面法优化筛选得到的显著因素。采用响应面法优化发酵条件可以将函数关系运用图形技术显示，凭借直觉观察其最优点。当然响应面优化需要一定的前期工作基础。结果显示接种量-装液量；接种量-葡萄糖；接种量-培养温度交互效应影响角鲨烯产量均不明显。这可能是因为接种量在跨度较大时，可较为明显影响角鲨烯产量，所以在Plackett-Burman实验中成为显著因素；在中心组合中，接种量跨度减小，其对角鲨烯产量影响减小，不显著。因而，可以得到结论：在发酵类酵母Pseudozymasp.SD301生产角鲨烯时，接种量大致控制在1.5%左右即可，不需要很严格控制，这也更加利于工业生产操作。

通过优化发现，葡萄糖、培养温度、接种量、装液量是影响角鲨烯发酵的显著因素。优化后发酵条件为:葡萄糖浓度为67.2 g·L-1、接种量为1.5%、培养温度为26℃、装液量在41 mL/250 mL。利用优化得到的理论最优发酵条件，进行250 mL摇瓶发酵，角鲨烯的产量为1.152 g·L-1，与响应面模型预测值相吻合。这一结果比未优化时的产量提高362%。说明该菌株具有潜力成为生产角鲨烯的工业菌株，响应面法优化发酵条件卓有成效。本实验为摇瓶水平实验，相信通过上罐发酵优化，优化培养基组成，特别是控制溶氧等手段可进一步提高角鲨烯产量。本研究为工业化海洋微生物产角鲨烯提供了菌株和发酵工艺，也为下一步发酵优化提供了工作基础。

致谢:感谢冯银刚研究员在文章修改过程中给予的宝贵指导；感谢马增新博士在实验过程中给予的大力帮助。

参考文献：

[1]许瑞波, 刘玮炜, 王明艳, 等. 角鲨烯的制备及应用进展[J]. 山东医药, 2005, 35: 69-70.

Xu Ruibo, Liu Weiwei, Wang Mingyan, et al. Progress in preparation and application of squalene [J]. Shandong Medicine, 2005, 35: 69-70.

[2]吴时敏. 角鲨烯的开发与利用[J]. 粮食与油脂， 2001(1): 36.

Wu Shimin. Developments and application of squalene [J]. Cereals&Oils, 2001(1): 36.

[3]赵振东, 孙震. 生物活性物质角鲨烯的资源及其应用研究进展[J]. 林产化学与工业， 2004， 24(3)： 107-112.

Zhao Zhendong, Sun Zhen. Research progress on natural resources and application of the bioactive substance -squalene[J]. Chemistry and Industry of Forest Products， 2004, 24(3)： 107-112.

[4]Bi Liang- wu, Zhao Zhen- dong, Han Lu- lu, et al. Review on some potential plant squalene resources[J]. Chemistry and Industry of Forest Products， 2011, 31: 102-108

[5] Scott J W， Valentine D J. Fcalie catalytic snytheses of squlaene [J]. Org Prep Proced Int, 1980， 12： 7-11.

[6] Bhattacharjee P, Shukla V B, Singhal R S, et al. Studies on fermentative production of squalene [J]. World Microb Biot, 2001, 17: 811-816.

[7] Okada S, Devarenne T P, Chappell. Molecular characterization of squalene synthase from the green microalgaBotryococcusbrauni[J]. Race B Arch Biochem Biophys, 2000, 373: 307-317.

[8] Lewis T E, Nichols P D, Mc Meekin T A. Sterol and squalene content of a docosahexaenoic-acid-producing thraustochytrid： Influence of culture age, temperature, and dissolved oxygen [J]. Mar Biotechnol, 2001, 3： 439-447.

[9] Kaya K, Nakazawa A, Matsuura H, et al. ThraustochytridAurantiochytriumsp. 18W-13a accummulates high amounts of squalene [J]. Biosci Biotechnol Biochem, 2011, 75: 2246-2248.

[10]Englund E, Pattanaik B, Lindberg P, et al. Production of squalene in Synechocystis sp. PCC 6803 [J]. PLos One, 2014, 9(3): e90270.

[11]Garaiová M, Zambojová V, Simová Z, et al. Squalene epoxidase as a target for manipulation of squalene levels in the yeast Saccharomyces cerevisiae[J]. FEMS Yeast Res, 2014, 14: 310-323.

[12]Akinori Katabami, Ling Li, Miki Iwasaki, et al. Production of squalene by squalene synthases and their truncated mutants in Escherichia coli[J]. Bioscience and Bioengineering, 2014, 1-7.

[13]Mi-Hee Chang, Hyeon-Jin Kim, Kwang-Yeop Jahng, et al. The isolation and characterization of Pseudozyma sp. JCC207, a novel producer of squalene[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2008, 78: 963-972. .

[14]HE Hanping, Cai Yizhong, Sun Mei．Extraction and purification of squalene from Amaranthus grain [J]．Agric Food Chem, 2002, 50: 368-372．

[15]Plackett R L, Burman J P. The design of optimum multifac-torial exeriments [J]. Biometrika, 1946, 33: 305-325.

[16]Rama Mohan Reddy, Reddy P, Seenayya G. Production of thermostble b-amylase and pullulanase by Clostridium thermosulf urogenes SV2 in solid- state fermentation: Screening of nutrients using Plackett-Burman design [J]. Bioproc Biosyst Eng, 1999, 21: 175-179.

[17]Xin Chen, Yin Li, Guo cheng Du, et al. Application of response surface methodology in medium optimization for spore production of Coniothyrium minitans in solid- state fermentation [J]. World J Microb Biot, 2005, 21: 593-599.

[18]Song X J, Zhang X C, Kuang C H, et al. Optimization of fermentation parameters for the biomass and DHA production of Schizochytrium limacinum OUC88 using response surface methodology[J]. Process Biochem, 2007, 42: 1391-1397.

[19]Chakravarti R, Sahai V. Optimization of compactin production in chemically defined production medium by Penicilli-umcitrinum using statistical methods [J]. Process Biochem, 2002, 38: 481-486.

[20]Shen N K, Wang Q Y, Lu Y, et al. Enhancing ethanol production using thermophilic yeast by response surface methodology[J]. Chin J Biotech, 2010, 26: 42-47.

[21]Zuo A L, Zhang W G. Medium optimization of SHMT formation by response surface analysis[J]. Biotechnology, 2008, 18(3): 45-49.

责任编辑徐环

技术报告

Optimization of Fermentation Conditions for Squalene Production by Marine Microbe Using Response Surface Methodology

WANG Xiao-Long1, TAN Yan-Zhen2,3, HOU Lu-Kuan1, CUI Qiu2,3,4, SONG Xiao-Jin2,3, LI Wen-Li1

(1. The Key Laboratory of Marine Drugs, Ministry of Education, School of Medicine and Pharmacy, Ocean University of China, Qingdao 266003, China；2.Qingdao Engineering Laboratory of Single Cell Oil, Qingdao 266101, China；3.Shandong Provincial Key Laboratory of Energy Genetics, Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266101, China；4.The Key Laboratory of Biofuels, Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266101, China)

Abstract:Fermentation conditions for squalene production by marine microbe Pseudozyma sp. SD301 were optimized in shake flask using response surface methodology (RSM). Based on the results obtained from the single factor tests, response surface analysis was designed with Design-Expert. The effects of glucose concentration, inoculation quantity, culture temperature and loading quantity on the yield of squalene were studied using RSM.By the central composite design,a predictive polynomial quadratic model was set up and the optimum fermentation conditions were developed.The theoretical optimal culture conditions are as follows: concentration of glucose was 67.2 g·L(-1)， inoculation quantity was 1.5% (v/v), culture temperature was 26 ℃, loading quantity was 41 mL in a 250 mL flask. Under these conditions, the yield of squalene reached 1.152g·L(-1), which is consistent with the predicted value of 1.1508 g·L(-1), representing a 3.62-fold increase compared to the original conditions.

Key words:squalene； fermentation optimization； plackett-burman； response surface methodology

DOI：10.16441/j.cnki.hdxb.20140443

中图法分类号：Q936

文献标志码：A

文章编号：1672-5174(2016)04-089-07

作者简介：王晓龙(1989-)，男，硕士生。E-mail：wangxiaolong1022@126.com**通讯作者：E-mail：liwenli@ouc.edu.cn

收稿日期：2015-01-07；

修订日期：2015-03-25

*基金项目：国家自然科学基金面上项目(31171201);国家自然科学基金青年基金项目(41306132)资助

Supported by the National Natural Science Foundation of China (31171201,41306132)