应用Xpert MTB/RIF技术快速诊断膝关节结核

唐恺 董伟杰 兰汀隆 范俊 李元 严广璇 秦世炳



·论著·

应用Xpert MTB/RIF技术快速诊断膝关节结核

唐恺 董伟杰 兰汀隆 范俊 李元 严广璇 秦世炳

目的 评价利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测技术(Xpert MTB/RIF，简称“Xpert”)在膝关节结核诊断中的临床应用价值。方法 连续收集2014年1月至2015年10月在首都医科大学附属北京胸科医院骨科接受手术治疗的49例膝关节病变患者的关节积液标本，每份标本同时分别行涂片抗酸杆菌检查、罗氏培养基培养、Xpert检测。以临床诊断为参考标准，评价Xpert检测关节积液标本中结核分枝杆菌的敏感度和特异度。结果 以临床诊断为参考标准，涂片、罗氏培养基培养、Xpert检测的敏感度分别为17.2%(5/29)、31.0%(9/29)、69.0%(20/29)，差异有统计学意义(χ2=8.34,P<0.05)；特异度分别为85.0%(17/20)、100.0%(20/20)、90.0%(18/20)。结论 Xpert检测关节积液标本中结核分枝杆菌的敏感度高，并且可同时检测其耐药性，可用于快速诊断膝关节结核。

结核,骨关节； 荧光定量核酸扩增检测技术； 聚合酶链反应； 诊断； 耐药性

结核病仍是发展中国家影响人类健康的主要传染病[1]。中国在22个结核病高负担国家中位居第二, 而且我国也是全球27个耐多药结核病高负担国家之一[2]。骨关节结核是常见的肺外结核，而膝关节结核是常见的骨关节结核。膝关节结核早期多表现为关节积液、滑膜增生，与其他类型的关节炎如骨性关节炎、非特异性关节炎、类风湿性关节炎、色素绒毛结节性滑膜炎等不易鉴别，待晚期发展到关节软骨脱落、骨质破坏可导致关节毁损，致残率很高[3]。因此，探索膝关节结核的早期诊断方法有重要的意义。

由于膝关节结核标本难以获取、样本含菌量低，其诊断效率不高。通常情况下，细菌学检查是诊断的金标准，但其阳性率较低,耗时长(平均需要1～2个月)，易造成漏诊或延误诊断。病变组织的病理检查也存在类似的问题。近10年来，分子生物学方法已经用于检测结核分枝杆菌DNA和相关耐药基因突变。利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测技术(Xpert MTB/RIF， 简称“Xpert”)是一种基于实时聚合酶链反应(real-time PCR)的技术[4]，是同时进行结核分枝杆菌及利福平耐药性检测的自动化、全封闭检测平台，检测时间仅需2 h[5-6]。2013年，WHO推荐将Xpert技术用于肺外结核的诊断[7]。然而，与痰液标本相比，膝关节结核临床标本存在标本异质性大、含菌量少、标本处理难度大等特点，Xpert用于检测膝关节结核临床标本的可行性及准确性如何，目前尚无相关报道。

本研究以英国国家卫生医疗质量标准署(National Institute for Health and Care Excellence，NICE)2011年制定的结核病诊疗与防控指南中骨关节结核临床诊断标准[8]作为膝关节结核诊断的重要诊断标准，探索Xpert技术对于膝关节结核诊断的敏感度和特异度，以及检测结核分枝杆菌利福平耐药基因rpoB突变的可行性与准确性。

材料与方法

一、标本收集与筛选

收集2014年1月至2015年10月在首都医科大学附属北京胸科医院骨科接受手术治疗的49例膝关节病变患者，通过关节穿刺或手术取得至少5 ml积液，对积液标本同时分别进行涂片抗酸杆菌检查、罗氏培养基培养和Xpert检测。

二、涂片抗酸杆菌检查

将关节积液进行涂片，采用金胺染色法染色，根据WHO指南[9]用发光二极管(LED)显微镜(奥林巴斯，日本)进行判读。

三、罗氏培养基培养

取约2 ml关节积液加入适量的N-乙酰-L-半胱氨酸-氢氧化钠(N-acetyl-L-cysteine-sodium hydroxide,NAC-NaOH)(Becton Dickinson，美国)去污，4 ℃ 3000×g离心20 min。弃去上清液，采用改良罗氏固体培养基(Gibco，美国)对沉淀物进行平行接种，分离培养分枝杆菌，培养阳性者行菌种鉴定，并采用改良罗氏绝对浓度间接法进行11种抗结核药物的敏感性试验。具体操作步骤参照《结核病诊断细菌学检验规程》[10]，11种待测药物的界限浓度如下(逗号前为下限浓度，逗号后为上限浓度)：异烟肼(1，10 μg/ml)、利福平(50，250 μg/ml)、链霉素(0，100 μg/ml)、乙胺丁醇(5，50 μg/ml)、左氧氟沙星(5，50 μg/ml)、对氨基水杨酸(1，10 μg/ml)、丙硫异烟胺(25，100 μg/ml)、帕司烟肼(0.1，1 μg/ml)、利福喷丁(5，250 μg/ml)、阿米卡星(10，100 μg/ml)、卷曲霉素(10，100 μg/ml)。

四、Xpert检测

根据Xpert操作规程[11]，取1 ml关节积液加入2 ml标本处理液中，轻微混匀至少10 s后室温孵育10 min；然后再次轻微混匀10 s后室温孵育5 min。取2 ml混合液加入至一次性标本盒中，将标本盒置入4通道Gene Xpert平台(Cepheid，美国)中自动运行。加入标本盒后约2 h，系统可自动读出结核分枝杆菌检测结果与利福平耐药结果。

五、临床诊断标准

NICE 2011年制定的骨关节结核临床诊断指南[8]为：(1)病变组织结核分枝杆菌培养阳性；(2)病变组织病理检查为干酪样坏死或典型的肉芽肿或朗格汉斯巨细胞；(3)影像学包括X线摄片、CT、MRI等检查符合结核表现；(4)抗结核药物治疗有效。以上4点任何一点符合即诊断为骨关节结核，均不符合者诊断为非结核性骨关节病变。

六、统计学分析

使用SPSS 17.0软件对数据进行分析，以NICE骨关节结核诊断指南为临床诊断参考标准，分别计算涂片、罗氏培养基培养和Xpert检测膝关节积液标本中结核分枝杆菌的敏感度和特异度。敏感度=真阳性例数/(真阳性例数+假阴性例数)×100%；特异度=真阴性例数/(真阴性例数+假阳性例数)×100%。罗氏培养基培养与Xpert的敏感度、特异度比较采用卡方检验(α=0.05)。

结 果

一、患者的临床特点

49例患者的中位年龄为46岁(3～76岁)；男26例，女23例。根据前述的临床诊断参考标准，29例患者诊断为骨关节结核、20例为非结核性骨关节病变。

二、3种方法检测膝关节积液标本的结果

1. 涂片、罗氏培养基培养和Xpert检测结果：见表1。

表1 49例患者关节积液标本分别采用3种方法检测的结果

续表1

2．各种检测方法的敏感度与特异度：按照表1结果，涂片、罗氏培养基培养和Xpert检测的敏感度分别为：17.2%(5/29)、31.0%(9/29)、69.0%(20/29)；特异度分别为：85.0%(17/20)、100.0%(20/20)、90.0%(18/20)。Xpert检测较罗氏培养基培养敏感度高(χ2=8.34，P<0.05)，差异有统计学意义；而特异度差异无统计学意义(χ2=0.53,P>0.05)。结核分枝杆菌罗氏培养基培养阳性的9例患者中，Xpert检出8例；在罗氏培养基培养阴性而临床诊断为结核的20例患者中，Xpert检出12例骨关节结核患者，敏感度为60.0%(12/20)。

三、Xpert检测结核分枝杆菌利福平耐药基因的结果

22例患者的Xpert检测结果为阳性，其中仅1例发现利福平耐药基因rpoB突变，其罗氏培养基培养结果也为阳性，表型药物敏感性试验结果显示为异烟肼、利福平、链霉素、左氧氟沙星耐药。

讨 论

膝关节结核是一种慢性进行性骨关节炎性疾病，分单纯滑膜结核、单纯骨结核、早期全关节结核和晚期全关节结核4种类型。因膝关节滑膜组织血供丰富，则以滑膜结核发病率较高，随着病程的进展，最后均可导致滑膜、关节软骨、软骨下骨组织及关节囊全部受累而成为全关节结核。膝关节结核早期的临床症状、实验室检查、影像学检查等无特异性，与骨性关节炎、类风湿性关节炎、非特异性关节炎、色素绒毛结节性滑膜炎等不易鉴别。晚期膝关节结核有严重的关节骨质与软骨破坏，有不同程度的死骨、脓肿和干酪样坏死组织形成，关节骨质严重毁损，关节功能完全丧失，对患者的生活及劳动能力造成严重影响。早期诊断膝关节结核对患者关节功能的预后有重要意义。

传统的检查方法包括关节积液的涂片、罗氏培养基培养、病理等，检出阳性率较低、耗时长，易造成漏诊或延误诊断。涂片检查阳性时，关节积液标本的结核分枝杆菌浓度≥10 000个/ml；罗氏培养基培养要求标本中至少含有10～100个活菌才能得到阳性结果，而且需要6～8周时间；滑膜组织的病理检查常提示肉芽组织慢性炎，与其他慢性关节炎不易鉴别[12]。

Xpert是一种基于real-time PCR的技术，能同时检测结核分枝杆菌及利福平耐药基因突变。与传统方法相比，Xpert技术具有以下优势。

1．操作简单，耗时短：Xpert检测仪是自动化、全封闭检测平台，该仪器自动完成标本的核酸提取、纯化及浓缩等试验步骤，这一过程在密闭的标本盒中进行。对所要检测的特定DNA序列具有很高的敏感度，辅以即时的光学检测软件使得一旦发现目标基因便可以得出结果，获得检测结果的时间仅为2 h。

2．敏感度、特异度高：现有的研究表明，Xpert检测肺外结核标本的敏感度为87.3%～95.0%，特异度为97.0%～100.0%[5,13-14]。这些肺外结核标本包括：胸腹腔积液、脑脊液、尿液、关节积液及穿刺取得的病变组织或淋巴结组织，病变组织需进行无菌研磨后，再进行Xpert检测。2011年，印度的Vadwai 等[13]应用Xpert检测肺外结核标本中的结核分枝杆菌，与固体或液体培养做对比，其敏感度为83.0%，特异度为73.0%。2014年，南非的Scott等[15]报道的敏感度为59.0%，特异度为92.0%。土耳其和德国进行类似研究报道的敏感度和特异度分别为67.7%～77.2% 和96.2%～98.4%[16-17]。

本研究单独对膝关节积液进行Xpert检测，发现其敏感度为69.0%，特异度为90.0%。与土耳其和德国的研究结果接近。本研究中在结核分枝杆菌培养阳性的患者中，Xpert的敏感度为8/9，在结核分枝杆菌培养阴性而临床诊断为骨关节结核的20例患者中，Xpert的敏感度为60.0%(12/20)。说明在传统方法检测结果为阴性时，Xpert技术可以为膝关节结核诊断提供更多的客观证据。

本研究是通过穿刺或手术取得关节积液标本进行检测，对于无关节积液的患者，可通过穿刺或手术取得滑膜组织，然后对滑膜组织进行无菌研磨，再进行Xpert检测，其准确性尚需进一步验证。

3．生物安全度高：由于Xpert技术的标本盒为相对密闭的系统，可以大大减少对外界的污染，可提高生物安全度，具备在有条件的基层医院开展的可行性。

4．早期诊断结核分枝杆菌耐药：Xpert技术不仅能检测结核分枝杆菌，而且能同时检测利福平耐药性。随着耐多药结核发病率的增高，早期获得结核分枝杆菌的药敏试验结果有助于制定适宜的化疗方案、缩短疗程[18-19]。本研究仅发现1例利福平耐药基因ropB突变患者，其表型药物敏感性试验结果显示为异烟肼、利福平、链霉素、左氧氟沙星耐药，两者结果相符。由于患者例数少，还需要大样本的试验进一步验证。

大多数骨关节结核诊断试验采用结核分枝杆菌培养结果作为结核诊断的“金标准”，然而由于样本中结核分枝杆菌含量低，其诊断效率过低。本研究采用NICE制定的临床诊断参考标准作为膝关节结核诊断的参考标准，它综合了结核分枝杆菌培养、组织学检查、影像学检查、临床疗效等因素，将结核分枝杆菌培养为阴性的部分患者诊断为膝关节结核，提高了诊断效率，但其同时也降低了特异度，而且不同的试验，对临床诊断标准的理解也不尽相同，由此可能得出不同的结论。

综上所述，Xpert MTB/RIF技术具有操作简单、耗时短、敏感度及特异度高、生物安全度高、早期诊断结核分枝杆菌耐药等优点。本研究为探索性验证试验，受限于样本量及单中心的局限性，所得数据仅能提示Xpert MTB/RIF技术在膝关节结核诊断中有一定价值。该技术未来在膝关节结核诊断中的应用前景仍需要进行多中心、大样本的诊断试验进行验证。

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(本文编辑：孟莉 范永德)

Study on rapid diagnosis of knee joint tuberculosis by Xpert MTB/RIF

TANGKai,DONGWei-jie,LANTing-long,FANJun,LIYuan,YANGuang-xuan,QINShi-bing.

DepartmentofOrthopedics,BeijingChestHospital,CapitalMedicalUniversity;BeijingBoneandJointTuberculosisDiagnosisandTreatmentCenter,Beijing101149,China

QINShi-bing,Email:qinsb@sina.com

Objective To evaluate the clinical value of Xpert MTB/RIF (Xpert) for the rapid diagnosis of knee joint tuberculosis. Methods Forty-nine joint effusion specimens from patients with knee disease admitted in Department of Orthopedic, Beijing Chest Hospital, Capital Medical University were collected from Jan. 2014 to Oct. 2015. Acid fast bacteria smear, Lowenstein-Jensen culture and Xpert detection were performed for each specimen. The sensitivity and specificity of Xpert were evaluated according to clinical diagnosis as reference standard. Results According to the clinical diagnosis as reference standard, the sensitivity of acid fast bacteria smear, Lowenstein-Jensen culture and Xpert were 17.2% (5/29),31.0% (9/29) and 69.0% (20/29), and the difference was significant (χ2=8.34,P<0.05); the specificity were 85.0% (17/20),100.0% (20/20), and 90.0% (18/20), respectively. Conclusion Xpert has high sensitivity in diagnosis of joint effusion infected by Mtb and detects simultaneously the drug resistance. It can be used to diagnose rapidly for knee joint tuberculosis.

Tuberculosis, osteoarticula; GeneXpert MTB/RIF； Polymerase chain reaction； Diagnosis; Drug resistance

10.3969/j.issn.1000-6621.2016.04.014

北京市科技计划课题(D141107005214002)

101149 首都医科大学附属北京胸科医院骨科 北京骨关节结核诊疗中心

秦世炳，Email：qinsb@sina.com

2016-01-12)