中药复方牛贝消核提取物治疗结核病相关靶标的研究

凌彦博 梁艳 王小美 王兰 张俊仙 阳幼荣 白雪娟 陈实兵 刘军 杨春玮 罗华锋 刘光陵 吴雪琼



·论著·

中药复方牛贝消核提取物治疗结核病相关靶标的研究

凌彦博 梁艳 王小美 王兰 张俊仙 阳幼荣 白雪娟 陈实兵 刘军 杨春玮 罗华锋 刘光陵 吴雪琼

目的 研究中药复方牛贝消核提取物治疗结核病的相关靶标，阐明其作用机制。方法 9只小鼠分为正常组、结核模型组和牛贝消核治疗组，每组3只。结核模型组和牛贝消核治疗组经尾静脉注射5×105CFU(菌落形成单位)的结核分枝杆菌H37Rv标准株的悬液感染7 d后，牛贝消核治疗组用牛贝消核水提取物进行灌胃。治疗12周后，杀鼠采血至抗凝管，提取小鼠全血总RNA，反转录后与小鼠基因表达谱芯片杂交，应用IPA(Ingenuity Pathway Analysis)数据库分析、比较各组间的基因表达结果，以差异变化倍数≥2.0作为基因表达明显上调或下调的判断标准。结果 结核模型组和正常组基因表达谱比较共有差异表达基因5647条，其中2898条上调，2749条下调。结核模型组和牛贝消核治疗组比较共有差异表达基因7051条，3454条基因上调，其中涉及多个免疫相关因子；3597条基因下调，c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)信号通路明显抑制下调。结论 牛贝消核提取物具有明显的免疫调节作用，具有下调JNK信号通路、抑制炎症的作用。

中草药； 结核； 药理作用分子作用机制； 基因表达谱

结核病是由结核分枝杆菌(Mtb)引起的呼吸道传染病。据世界卫生组织估计，全世界约有1/3的人口被Mtb感染，2013年全球新发结核病患者900万例，150万例死于结核病[1]。我国是世界22个结核病高负担国家之一，第五次全国结核病流行病学抽样调查结果表明，我国现有结核病患者500万例，对一线抗结核药物的耐药率达36.8%，耐多药率达6.8%。因此，结核病耐药问题是目前亟待解决的难点之一。

中医药是我国传统医学的精髓代表，中药治疗的最大优势是多成分、多靶点、多系统、低毒性地发挥综合作用。结核病在中医称之为痨病，传统医学认为该病的产生有内外两方面因素，外因为感染痨虫，内因为正气虚弱、气血不足、阴精耗损所致。由此可见，痨虫是发病的因素，正气虚弱是发病的基础，体虚感染痨虫是形成本病的关键[2]。传统医学针对结核病产生的内外因进行治疗具有独特的优势，“一则补其虚，复其真元；一则杀其虫，以绝其根本”[3]。因此，中药治疗结核病具有其自身独特的优势。

牛贝消核是结合长期的临床实践和结核病自身的发病特点，总结出的一个由川贝母、桔梗、白芨、牛蒡子、鱼腥草、糯米六味药配伍而成的民间经验方，其中川贝母、白芨二药相辅作为君药，鱼腥草、桔梗、牛蒡子三味俱为臣药，以补脾胃、益肺气的糯米为佐使药。本方通过6 种中药的合理配伍、相互作用，使其达到清热解毒、软坚化结及滋阴润肺、止咳化痰、托旧生新、消肿止血、抗菌消炎的功效，临床可用于Mtb感染引起的各型肺结核，尤其是耐多药结核病和广泛耐药结核病。经过临床验证及动物实验证明，本中药复方具有抑制或杀灭Mtb、缓解化疗药物不良反应、有效缓解结核中毒症状、增强机体免疫力、降低耐药结核病发生率的优点，安全、无不良反应[ 4-6]。因此，本研究采用中药复方牛贝消核提取物治疗小鼠结核模型后，检测基因表达谱并观察其变化，旨在寻找该药物影响疾病发生和转归的关键信号通路和关键靶基因，以阐明其作用机制。

材料和方法

1.实验动物与主要试剂：5～6周雌性BALB/c小鼠购自军事医学科学院，体质量20～22 g，无特定病原体(specific pathogen free，SPF)级。中药牛贝消核水提取物由广东奇方药业有限公司制备。基因表达谱芯片购自安捷伦公司(Agilent，USA)。

2.小鼠结核模型的制备：9只小鼠按照数字表法随机分入下列3个实验组：(1)正常对照组：作为空白对照组，每天分别对各组小鼠采用0.5 ml蒸馏水进行灌胃；(2)结核模型组：小鼠经尾静脉注射5×105CFU(菌落形成单位)的结核分枝杆菌H37Rv标准株。感染7 d后，每天分别对各组小鼠采用0.5 ml蒸馏水进行灌胃；(3)牛贝消核治疗组：小鼠经尾静脉注射5×105CFU的结核分枝杆菌H37Rv标准株，感染后7 d，将水提取物牛贝消核60 mg溶于10 ml灭菌蒸馏水中，每天分别对该组小鼠采用牛贝消核溶液0.5 ml进行灌胃。实验过程中，每周对小鼠称重1次，6周后摘除眼球杀鼠采血，放在乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中，混匀。

3.小鼠全血总RNA的提取和纯化：采用RNA提取试剂盒(Qiagen公司，德国)对小鼠全血进行总RNA的提取和纯化；RNA的质量检测使用NanoDrop ND-1000(Thermal公司，美国)超微量紫外检测仪，使RNA的A260/A280在1.80～2.10之间。

4.小鼠基因表达谱芯片检测：提纯的总RNA在上海康成生物技术有限公司进行基因表达谱芯片检测。具体方法如下：反转录的cDNA并用Cy3荧光素标记后，分别与4×44 K基因表达谱芯片在42 ℃条件下杂交16～20 h，将芯片放入安捷伦微阵列芯片扫描仪(Agilent Microarray Scanner)，读取数据。

5.数据处理和分析：采集的数据采用基因组百科全书(KEGG数据库)和IPA(Ingenuity Pathway Analysis)数据库(Ingenuity公司，美国)进行分析。以差异变化倍数≥2.0作为基因表达明显上调或下调的判断标准。

结 果

一、差异表达的基因

结核模型组和正常组基因表达谱比较，共有差异表达基因5647条，其中2898条上调，2749条下调；结核模型组和牛贝消核治疗组比较，共有差异表达基因7051条，其中3454条上调，3597条下调。差异倍数大的部分基因及其分子功能注释见表1。

二、中药治疗前后差异表达基因的基因本体(GO)分析

与正常组比较，结核模型组小鼠表达上调的基因主要参与了下列过程：1278个上调基因参与了细胞过程的调节，1092个参与了代谢过程的调节，959个参与了初级代谢过程的调节，949个参与了细胞代谢过程，847个参与了生物调节，817个参与了大分子代谢过程，813个参与了生物学过程的调节，763个对细胞过程的调节，752个参与了大分子代谢过程，622个氮化合物代谢过程。

与正常组比较，结核模型组小鼠表达下调的基因主要参与了下列过程：1258个上调基因参与了细胞过程，940个参与了代谢过程，933个参与了生物调节，889个参与了生物过程的调节，839个参与了细胞过程的调节，795个参与了初代谢过程，773个参与了细胞代谢过程，871个对刺激物应答，819个参与了大分子代谢过程，739个多细胞生物过程。

表1 牛贝消核治疗后表达明显上调的部分基因在结核模型组、牛贝消核治疗组与正常组比较的结果及其分子功能注释

表2 牛贝消核治疗后表达明显下调的部分基因在结核模型组、牛贝消核治疗组与正常组比较的结果及其分子功能注释

与结核模型组比较，牛贝消核治疗组表达上调的基因主要参与了下列过程：1612个上调基因参与了细胞过程，1207个参与了代谢过程，1188个参与了生物调节，1134个参与了生物过程的调节，1055个参与了细胞过程的调节，1021个参与了一级代谢过程，985个参与了细胞代谢过程，871个对刺激物应答，819个参与了大分子代谢过程，739个多细胞生物过程。

与结核模型组比较，牛贝消核提取物治疗组表达下调的基因主要参与了下列过程：1421个下调基因参与了细胞过程，1163个参与了代谢过程，986个参与了一级代谢过程，974个参与了细胞代谢过程，927个参与了生物调节，888个参与了生物过程的调节，845个参与了细胞代谢过程，773个参与大分子代谢过程，695个参与了细胞大分子代谢过程，680个参与了应激反应。

三、信号通路的分析预测

应用IPA数据库对表达谱结果进行信号通路分析预测发现，许多信号通路均受到影响，但结核模型组与正常组比较，c-jun氨基末端激酶(c-jun N-terminal kinase，JNK)通路明显上调；而牛贝消核治疗组与结核模型组相比，JNK通路明显下调，JNK通路分析结果见图1。

上图为牛贝消核治疗组与结核模型组比较，下图为结核模型组与正常组比较，图中深绿色代表大幅下调，淡绿色代表小幅下调，蓝色代表预测可能下调，橙色代表大幅上调，粉色代表小幅上调 图1 应用IPA数据库分析JNK通路基因差异表达结果

讨 论

本研究通过测定中药复方牛贝消核提取物治疗后小鼠转录组学基因表达谱的变化，紧密结合中药复方整体作用的特点，开展中药功能靶点的研究，旨在发现和揭示对结核病治疗和转归起关键作用的信号通路与关键基因靶点网络，在整体层面阐释中药的作用机制，为方剂制剂的研究与应用提供理论依据，为复方的设计与优化及中西医结合治疗奠定实验基础。

本研究在小鼠Mtb感染后表达明显上调和下调的部分基因，在牛贝消核提取物治疗后发生了明显的变化：(1)牛贝消核治疗后IL-17、TNF、TNFAIP6、CXCL1、CXCL2和CXCL9的表达均明显上调，抗结核感染的保护性免疫依赖于细胞因子调节的T细胞和巨噬细胞活化，Th17细胞是一个分泌IL-17 的CD4+T细胞亚群，IL-17也可由CD8+T细胞、γδ T 细胞和NK T细胞等细胞产生，Th17诱导或促进Th1细胞的抗结核免疫应答，在宿主抗结核感染中发挥重要作用[7]；TNF-α 是由巨噬细胞、树突状细胞或T细胞分泌的细胞因子，与IFN-γ具有协同作用，激活被Mtb感染的巨噬细胞，促进对胞内病原菌的杀伤功能，募集巨噬细胞和淋巴细胞迁移至感染部位，促进肉芽肿的形成，目前研究发现应用TNF-α抑制剂可能导致Mtb播散[8]；TNF-α诱导蛋白6(tumor necrosis factor alpha induced protein 6，Tnfaip6)是透明质酸结合蛋白家族的一个新成员，可诱导炎性细胞因子(TNF-α、IL-1)分泌，可能在炎症发生期间参与细胞-细胞、细胞-基质间的相互作用[9]。CXCL1 [Chemokine (C-X-C motif) ligand 1]、CXCL2和CXCL9均属于CXC趋化因子家族的小分子细胞因子，CXCL1趋化因子是由巨噬细胞、中性粒细胞和上皮细胞表达的，有细胞趋化作用；CXCL2是专门负责单核细胞募集和迁移的化学因子；CXCL9是T细胞趋化因子，都在结核肉芽肿的形成中发挥重要作用[10]；目前研究显示，这些免疫基因下调可能与疾病严重程度相关[11]。因此，本研究结果证明牛贝消核提取物能够很好地调动机体的抗结核细胞免疫。(2)呼吸道中固有免疫应答的主要因子α防御素相关序列2(defensin, alpha, related sequence 2，Defa-rs2)表达明显上调[12]；SPARC/骨粘连蛋白、CWCV和KAZAL样域蛋白多糖1[sparc/osteonectin, cwcv and kazal-like domains proteoglycan 1，即睾丸蛋白聚糖1(SPOCK1)]表达明显上调，激活JAK-STAT信号通路，诱导感染的巨噬细胞凋亡[13]；泛素连接酶PDZRN3(PDZ domain containing RING finger protein 3)表达上调，自噬作用增强[14]；GTP酶DNM1 (dynamin 1)表达明显上调，促进了内呑作用[15]，这些都加强了牛贝消核的抗结核作用。(3)一个免疫球蛋白分子由2条轻链(L链)和2条重链(H链)通过二硫键连接而成，结核感染后抗体轻链和重链均增高，说明抗体水平增高，Th2型免疫增强，这与目前研究的结核病免疫机制是一致的，结核病患者由Th1型向Th2型免疫转化[16]。牛贝消核治疗后抗体轻链和重链均明显下降，说明牛贝消核能在小鼠体内激发Th1相关的免疫应答，抑制Th2相关的免疫应答，使Th2向Th1转化，而发挥有效的治疗作用。(4)感染后炎症通路的调控因子如Foxp1(forkhead box P1)、Eif4g3(eukaryotic translation initiation factor 4 gamma, 3)和Retnlg表达明显上调，调控促炎细胞因子的分泌，促进炎症反应[17]；而中药治疗后这些因子表达明显下调，可能减轻炎症及炎症损伤，控制了结核病的进展。上述许多基因和蛋白与结核病的关系目前国内外未见研究报道，笔者首次发现结核感染后这些基因和蛋白参与了结核炎症反应。

c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)信号转导通路, 是丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路的一个分支，它在细胞周期、生殖、凋亡和细胞应激等多种生理和病理过程中起重要作用。目前的研究已证明，当细胞受各种各样的刺激(如生长因子、脂多糖、肿瘤坏死因子、白细胞介素-1等)发生应激时可激活JNK表达特异性蛋白酶和细胞因子，而在慢性炎症性疾病中发挥重要作用[18]；此外，JNK具有促进细胞凋亡的能力[19]。JNK信号通路功能失调可造成慢性炎症性疾病[20]。本研究首次发现Mtb感染小鼠后，JNK信号转导通路明显上调，提示JNK信号转导通路可能是结核细胞因子网络的重要作用靶标，它一方面促进炎症反应；另一方面促进小鼠巨噬细胞发生凋亡，杀死寄生于巨噬细胞内的Mtb，从而阻止Mtb在体内的播散[21]；但感染初期大量巨噬细胞凋亡可能不利于抗原提呈，而使机体难以诱导细胞免疫应答[22]。由此可见，JNK信号通路在结核病的发生、发展中也发挥了关键作用，通过对炎症反应的正负反馈调控作用，使炎症反应体系达到一个新的动态平衡水平。

本研究应用牛贝消核提取物治疗感染Mtb的小鼠后，发现其JNK通路被明显抑制，逆转了Mtb感染导致的JNK通路上调，提示牛贝消核提取物作用于JNK信号通路并阻抑该通路的功能，减弱细胞对应激抗原的应答，抑制Mtb引起的炎症反应；但它也抑制了巨噬细胞的凋亡，可能导致Mtb在胞内存活和繁殖[21]。因此，JNK通路的调控呈现复杂性和多面性。本研究试图阐明JNK信号通路的转导及调节在结核炎症反应的动态平衡中发挥重要作用，通过调节信号转导网络调控的异常也可能有益于结核病慢性炎症的控制，可能成为结核病有效治疗的新靶标。

总之，牛贝消核提取物具有明显的免疫调节作用，通过加强巨噬细胞的吞噬、抑菌作用，提高Th1型免疫，抑制Th2型免疫，下调JNK通路抑制炎症反应，发挥抗结核治疗作用。本研究运用转录组学的方法发现了中药复方牛贝消核在治疗结核病的可能的作用靶标JNK通路，对未来研发针对该分子靶标的抗结核新药具有指导意义。

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(本文编辑：薛爱华)

The study on the targets of the antituberculosis effect of traditional Chinese medicine Niubeixiaohe extracts

LINGYan-bo*,LIANGYan,WANGXiao-mei,WANGLan,ZHANGJun-xian,YANGYou-rong,BAIXue-juan,CHENShi-bing,LIUJun,YANGChun-wei,LUOHua-feng,LIUGuang-ling,WUXue-qiong.

*ArmyTubercu-losisPreventionandControlKeyLaboratory,BeijingKeyLaboratoryofNewTechniquesofTuberculosisDiagnosisandTreatment,InstituteforTuberculosisResearch,The309thHospitalofPLA,Beijing100091,China

WUXue-qiong,Email:xueqiongwu@139.com

Objective To study the targets of the anti-tuberculosis effect of traditional Chinese medicine Niubeixiaohe extracts, and analyze its mechanism. Methods Nine mice were divided into three groups: Normal control group, TB model group and Nubeixiaohe treatment group, 3 mice each group.The mice in TB model group and Nubeixiaohe treatment group were injected via the tail vein with 5×105CFUs ofM.tuberculosis(Mtb) H37Rv. At 7 days after infection, the mice in Nubeixiaohe treatment group were administered with Niubeixiaohe extracts by gavage for 12 weeks. Mice were collected the bloods in anticoagulative tube. The total RNAs of mouse whole bloods were extracted, reversed transcription, and then hybridized with gene expression chips. The data were analyzed with IPA (Ingenuity Pathway Analysis) database to find the difference of gene expression between different groups. More than 2.0-fold of gene expression difference was considered as the criteria of significantly upregulation or downregulation. Results There were 5647 genes differentially expressed between TB model group and normal control group (2898 upregarded expression and 2749 downregarded expression). Of 7051 genes differentially expressed between TB model group and Nubeixiaohe treatment group, 3454 were up-regulated expression, in which more genes involve multiple immune-related factors; 3597 were down-regulated expression, in which the genes in c-Jun N-terminal kinase (JNK) signal pathway were significantly down-regulated in treatment group. Conclusion Niubeixiaohe extracts had immunomodulatory related effects, and had a role of anti-inflammation by inhibiting JNK pathway.

Drugs, Chinese Herbal； Tuberculosis; Molecular mechanisms of pharmacological action； Gene expression profiling

10.3969/j.issn.1000-6621.2016.01.006

北京市十病十药研发项目(Z141100002214002)

100091 北京，解放军第三〇九医院全军结核病研究所 全军结核病防治重点实验室 结核病诊疗新技术北京市重点实验室(凌彦博、梁艳、王小美、王兰、张俊仙、阳幼荣、白雪娟、陈实兵、刘光陵、吴雪琼)；广东奇方药业有限公司(刘军、杨春玮、罗华锋)

吴雪琼，Email：xueqiongwu@139.com

2015-11-23)