丹酚酸组分中7种酚酸类成分对缺氧损伤的人脐静脉内皮细胞保护作用的研究お

韩秀娟 刘丹 封亮�├畛� 贾晓斌 董自波

[摘要]该文采用连二亚硫酸钠（Na2S2O4）体外诱导人脐静脉内皮细胞（HUVEC）缺氧损伤模型，以丹酚酸组分对HUVEC缺氧损伤的保护作用为切入点，采用MTT比色法测定细胞活力，试剂盒测定细胞超氧化物歧化酶（SOD）活力、丙二醛（MDA）含量、乳酸脱氢酶（LDH）含量、一氧化氮（NO）含量及白细胞介素6 （IL6）和肿瘤坏死因子α（TNFα）的表达，探讨7种丹参酚酸类成分在丹酚酸组分对Na2S2O4诱导的HUVEC缺氧损伤模型的保护作用中发挥的作用。在组分结构理论指导下，研究丹酚酸组分中主要化学成分在丹酚酸抗缺氧损伤药效发挥过程中的贡献度，结果显示，丹酚酸B，迷迭香酸，丹酚酸A，丹参素，紫草酸5种成分在丹酚酸组分抗缺氧损伤作用中的贡献度较大，对这5种成分分别进行组合给药，初步得到丹酚酸B，迷迭香酸，丹酚酸A，丹参素4种成分组合能够作为丹酚酸组分的代表性成分。

[关键词]丹酚酸组分；缺氧损伤；贡献度

中药是一个多成分的复杂体系，是化合物丰富的宝库。组分结构理论认为，中药物质基础是由多成分构成的，且多种成分并不是简单的堆积，而是一个有序的整体，单体成分是最基本的单位，相似的单体成分按照一定的比例构成了组分，不同的组分又按照一定的比例构成了中药的整体[1]。中药发挥药效强调整体性，各个成分对中药整体药效存在不同贡献作用。本研究借助Na2S2O4体外诱导HUVEC细胞缺氧损伤模型[2]，研究丹酚酸组分中7种酚酸类成分在丹酚酸组分发挥抗缺氧损伤药效的贡献度，以期为科学评价丹酚酸组分提供一些依据。

丹参为鼠尾草属植物丹参Salviae miltiorrhiza的干燥根或根茎，具有活血调经、祛淤止痛、凉血消痈、清心除烦等功效[3]。丹酚酸组分为丹参的水溶性酚酸成分，主要有丹酚酸A（salvianolic acid A）、咖啡酸（caffeic acid）、丹酚酸B（salvianolic acid B）、迷迭香酸（posrnarinic acid）、紫草酸（lithospermic acid）、原儿茶醛（protocatechualdehyde ）、丹参素（lactic acid）等[4]，具有抗脂质过氧化、消除自由基、保护线粒体、调节能量代谢、抗心肌缺血等生物活性，是治疗心血管疾病的主要药效物质[56]。

本研究采用化学试剂Na2S2O4诱导建立HUVEC缺氧模型，借此模拟心肌缺血缺氧微环境，MTT法研究了丹酚酸组分、7种丹参酚酸成分对Na2S2O4诱导的HUVEC缺氧损伤的保护作用，以细胞存活率为指标[7]，对其抗缺氧活性进行客观地量化评价，计算各成分在丹酚酸组分抗缺氧效果中所占的贡献度，从而找出丹酚酸组分中抗缺氧主要的药效物质，以期为科学评价丹酚酸组分提供依据。

1材料

Agilent 1200 高效液相色谱仪（包括四元泵，自动进样器，DAD二极管阵列检测器）；METTLERAL204天平 （1/10万，梅特勒托利多仪器有限公司）；HH4数显恒温水浴锅（国华电器有限公司）；二氧化碳培养箱（Thermo Electrom公司）；生物安全柜（Labconco Purifier Class Ⅱ Biosafety Cabinet）；LDZK50KB立式压力蒸气灭菌器（安海申安医疗器械厂）；低速大容量多管离心机（Anke TDL40B型，上海安亭科学仪器厂产品）；微量移液器（Thermo，美国）；高速冷冻离心机（美国Beckman公司）；MilliQ纯水机（美国Millipore公司）；全自动酶标仪（Thermo Electrom公司）；细胞计数器[XBK25（1/400 mm2）]。

丹酚酸组分（西安鸿生生物技术有限公司，批号140714）；连二亚硫酸钠（美国Sigma公司）；丹参素钠，迷迭香酸，紫草酸，原儿茶醛，咖啡酸，丹酚酸A，丹酚酸B对照品均购自成都曼斯特生物制品有限公司，批号分别为14030108，14020115，14052702，14021902，14030510，14072511，14052113。

DMEM低糖不完全培养基（南京凯基生物发展公司）；胰蛋白酶（Sigma公司）；胎牛血清（杭州四季青生物工程有限公司）；二甲基亚砜（DMSO，南京化学试剂有限公司）；MTT（美国Sigma公司）；白细胞介素6（IL6）含量测定试剂盒，肿瘤坏死因子α（TNFα）ELISA测定试剂盒，超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）、乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒均购于南京建成生物工程研究所。甲醇为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

人脐静脉内皮细胞株（HUVEC） 购自南京凯基生物发展公司。

2方法与结果

21色谱条件Hedera ODS2色谱柱（46 mm×250 mm，5 μm）；流动相乙腈（A） 15%甲酸（B），梯度程序洗脱（0～6 min，5%～13%A；6～13 min，13%～15%A；13～25 min，15%～18%A；25～34 min，18%～21%A；34～50 min，21%～25%A；50～60 min，25%～62%A）；流速10 mL·min-1；检测波长286 nm；进样量10 μL。样品和对照品均可实现基线分离，测定均无干扰（图1）。

22对照品溶液制备及方法学考察分别精密称取丹参素钠对照品091 mg，原儿茶醛对照品129 mg，咖啡酸对照品080 mg，迷迭香酸对照品090 mg，紫草酸对照品096 mg，丹酚酸B对照品166 mg，丹酚酸A对照品142 mg，分别置于10 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，得质量浓度为9100，12900，8000，9000，9600，16600，14200 mg·L-1的对照品溶液。分别精密吸取对照品溶液05，10，25，40，50，75 mL至10 mL量瓶中，用甲醇

稀释并定容，摇匀，用045 μm微孔滤膜过滤，取滤液，进行HPLC测定其对应的峰面积，以浓度为横坐标，对应的峰面积为纵坐标，进行线性回归，得回归方程（表1）。

精密度试验：精密吸取7种成分的对照品溶液进行精密度考察。按色谱条件连续5次进样，计算丹参素，原儿茶醛，咖啡酸，迷迭香酸，紫草酸，丹酚酸B，丹酚酸A峰面积的RSD分别为093%，056%，034%，065%，095%，088%，10%，表明仪器的精密度良好。

重复性试验：精密称取丹酚酸组分样品平行制备6份供试品，连续进样，测定丹参素，原儿茶醛，咖啡酸，迷迭香酸，紫草酸，丹酚酸B，丹酚酸A含量的RSD分别为11%，15%，11%，16%，13%，19%，17%，表明重复性均良好。

稳定性试验：取丹酚酸组分样品，分别在0，2，4，8，12，24 h时HPLC测定峰面积，计算各成分的含量，丹参素，原儿茶醛，咖啡酸，迷迭香酸，紫草酸，丹酚酸B，丹酚酸A含量的RSD分别为11%，20%，15%，17%，12%，12%，17%，说明供试品溶液在24 h内各成分稳定性较好。

加样回收率试验：精密称取已知含量的丹酚酸组分样品，制备成供试品溶液6份，吸取10 mL，置10 mL量瓶中，分别精密加入丹酚酸B对照品，蒸馏水定容至刻度，计算丹酚酸B的平均加样回收率为9849%。

23统计学处理实验过程中所产生数据均采用SPSS 160 进行处理，各组间数据比较采用t检验，用±s表示，P<005为有统计学意义。

24MTT法筛选Na2S2O4的造模浓度以及药物给药浓度取对数生长期的HUVEC，将其消化后调整细胞密度为1×105个/mL，均匀接种于96孔板上，置于37 ℃，5% CO2的培养箱中培养24 h，吸弃培养基，分别进行筛选试验：①分别加入含终浓度为01，02，05，10，15，20，50，100 mmoL·L-1 Na2S2O4的不完全DMEM低糖培养基100 μL；②分别加入含终浓度为 1×10-3，8×10-4，5×10-4，2×10-4，1×10-4，5×10-5，1×10-5 g·mL-1丹酚酸组分的不完全DMEM低糖培养基100 μL，每个浓度均设6个复孔，置于37℃，5%CO2条件的培养箱中作用24 h后，吸弃上层培养基，每孔加入500 mg·L-1 MTT 100 μL，在培养箱中培养4 h后，吸弃孔内培养基，每孔加入100 μL二甲基亚砜（DMSO），37 ℃恒温振荡10 min，全自动酶标仪测定各孔吸光度（A）。

细胞存活率=（A细胞给药组-A空白给药组）/（A细胞空白组-A空白组）×100%

根据MTT实验结果，确定后继实验中Na2S2O4以及药物的给药浓度。当细胞存活率大于95%时可认为药物对细胞无毒性。结果表明，丹酚酸组分质量浓度为1×10-5，5×10-5，1×10-4，2×10-4，5×10-4 g·mL-1时，细胞存活率均在95%以上，当丹酚酸组分质量浓度增加至8×10-4 g·mL-1时，细胞存活率开始下降（表2）。综合分析，选用5×10-4 g·mL-1作为后续实验中的给药浓度。

当Na2S2O4浓度为01，02 mmol·L-1时，对细胞凋亡作用不明显。随着Na2S2O4浓度的增加，细胞损伤明显，存活率呈明显下降趋势。当Na2S2O4浓度为20 mmol·L-1时，细胞存活率为4875%，此时细胞损伤适中（图2），故选择20 mmol·L-1的Na2S2O4作为造模浓度。

25丹酚酸组分及7种酚酸类成分对缺氧损伤的HUVEC存活率的影响实验分为10组，分别为空白对照组、模型组（Na2S2O4组）、丹酚酸组分组、丹参素组、原儿茶醛组、咖啡酸组、迷迭香酸组、紫草酸组、丹酚酸B组、丹酚酸A组，其中各单体组中成分含量相当于丹酚酸组分中各种成分的含量。取对数生长期的细胞，将其消化后调整细胞密度接种于96孔板中，于37 ℃，5% CO2的培养箱中培养24 h后，除空白对照孔外每孔均加入终浓度为2 mmol·L-1的Na2S2O4不完全培养基，于37 ℃，5% CO2的培养箱中作用24 h后吸弃培养基，给药组进行细胞给药，于37 ℃，5% CO2的培养箱孵育24 h，MTT法检测细胞活性。

根据7种丹参酚酸化学成分及丹酚酸组分对缺氧损伤的HUVEC存活率的影响，计算各成分对缺氧损伤HUVEC的保护作用，以模型组及丹酚酸组分组对HUVEC的存活率为标准，计算各成分对丹酚酸组分整体抗缺氧损伤的贡献度C。

C=Ix/Iw×100%（1）

Iw为丹酚酸组分对缺氧损伤HUVEC的保护作用；Ix为各化学成分（浓度相当于丹酚酸组分中的含量浓度）对缺氧损伤HUVEC的保护作用。

I=给药组细胞存活率-模型组细胞存活率

根据以上公式，计算丹酚酸组分中7种酚酸成分对缺氧损伤HUVEC保护作用的贡献度。丹酚酸组分中各成分对缺氧损伤的HUVEC均具有一定的保护作用（图3）。

根据7种丹酚酸类成分对缺氧损伤的HUVEC存活率的影响，计算各样品对缺氧损伤的HUVEC细胞的保护作用（表3）。

26丹酚酸组分不同成分组合对缺氧损伤HUVEC细胞的影响对7种丹参酚酸成分对缺氧损伤的HUVEC保护作用的贡献度大小进行排序，选择贡献度较大成分进行组合给药。实验分为8组，空白对照组、模型组（Na2S2O4组）、丹酚酸组分组、丹酚酸B组、丹酚酸B+迷迭香酸组、丹酚酸B+迷迭香酸+

丹酚酸A组、丹酚酸B+迷迭香酸+丹酚酸A+丹参素组、丹酚酸B+迷迭香酸+丹酚酸A+丹参素+紫草酸组，其中各单体组合组中成分含量相当于丹酚酸组分中各种成分的含量。取对数生长期的细胞，将其消化后接种于6孔板中，种板及给药步骤同24项。细胞给药后于37 ℃，5% CO2培养箱中培养24 h，吸弃培养基，每孔加入细胞裂解液，冰上裂解30 min，4 ℃下15 000 r·min-1离心3 min，收集上清，进行试剂盒相关指标测定。

正常机体内存在一定活性的抗氧化酶如超氧化物歧化酶（SOD）等构成的天然抗氧化系统，SOD是清除过量氧自由基系统中的抗氧化酶之一，其活性能够反映机体抗氧化能力。丙二醛（MDA）是机体脂质过氧化的产物之一，间接反映机体组织自由基含量[8]。乳酸脱氢酶（LDH）是胞内酶，其漏出量的多少可反映细胞膜的受损程度[9]。一氧化氮（NO）可促进血管舒张，减少血栓的形成，但高浓度的NO 则会诱发细胞毒性，增加血管通透性，进而导致血管壁损害[10]。结果显示，经Na2S2O4刺激后的细胞，模型组SOD的活性显著降低（P<001），MDA，LDH和NO显著升高，与空白对照组相比，均具有显著差异（P<001）。与模型组相比，经药物处理后，各给药组均能降低LDH，MDA，NO含量，同时提高SOD的活性，且具有统计学意义（P<005或P<001），表明丹酚酸组分及其各成分组合可抑制Na2S2O4诱导的细胞缺氧损伤，对内皮细胞具有一定的保护作用。与丹酚酸组分相比，丹酚酸B+迷迭香酸+丹酚酸A+丹参素+紫草酸组和丹酚酸B+迷迭香酸+丹酚酸A+丹参素组改善SOD，MDA，LDH和NO释放作用，无显著差异（表4）。

白细胞介素6 （IL6）是机体免疫、内分泌调节的主要分子，与炎症调节和免疫反应有关。肿瘤坏死因子α（TNFα）是由被激活的单核细胞、巨噬细胞分泌的一种可溶性多肽类细胞因子。TNFα可刺激内皮细胞产生血小板激活因子，还对血管内皮细胞产生直接细胞毒副作用，破坏其结构和功能的完整性，促进炎性介质分泌，参与血管平滑肌细胞的增殖、分化和调控，使血管壁增厚，管腔狭窄[11]。结果显示，与空白组对比，细胞经缺氧造模后，炎症因子TNFα， IL6的表达显著增高（P<001）；与模型组相比，经药物处理后，各给药组均能降低TNFα， IL6的表达，具有统计学意义（P<005或P<001），表明丹酚酸组分及其各成分组合均对内皮细胞具有一定的保护作用；与丹酚酸组分相比，丹酚酸B+迷迭香酸+丹酚酸A+丹参素+紫草酸组和丹酚酸B+迷迭香酸+丹酚酸A+丹参素组改善TNFα，IL6的表达，无显著差异（表5）。

3讨论

中药组分中成分较为复杂，不同成分之间的含量和生物活性存在着明显的差异。在进行中药组分的评价研究时不可能兼顾到每个化学成分，但也不能盲目地挑选某个指标成分代表组分整体[12]。因此，如何科学、合理的从组分的众多成分中筛选出具有代表性且贡献度较大的成分，使其整体性质能够体现组分的特性，进而体现中药（复方）的整体特性，是现代中药研究的重点[1314]。本研究在考虑组分内各成分含量和生物活性的前提下，对组分内有限个成分进行配伍配比后，选择药理作用与组分整体的药理作用无统计学差异的成分组合，那么这些成分的综合性质就可以表征该组分整体的性质。

丹参是治疗心脑血管疾病的良药，水溶性丹酚酸类成分是丹参主要药效物质基础[15]，丹酚酸类成分具有不同程度的抗氧自由基、抗炎和抗细胞内钙超负荷作用。本研究针对丹酚酸组分中7种酚酸成分抗HUVEC细胞缺氧损伤作用进行研究，借助Na2S2O4诱导内皮细胞的缺氧损伤，导致细胞产生脂质过氧化反应，使血管内皮功能出现紊乱。血管内皮细胞功能是导致心血管疾病的发生和发展的关键因素，内皮细胞处于缺氧状态可导致大量活性氧的产生。通过MTT 实验筛选出最合适的造模浓度，模拟心肌缺血缺氧微环境，进一步考察丹酚酸组分中不同成分对缺氧损伤人脐静脉内皮细胞的保护作用。在各成分组合给药与组分整体的作用结果比较中，单个成分或2个成分组合的药理作用明显不如组分整体的药理作用。由此可见，目前文献和药典中单指标成分对组分进行质量控制并不科学。基于用药方便、质量可控原则，结合本研究实验结果贡献度分析，代表丹酚酸组分整体性质的有限个代表性成分为丹酚酸B、迷迭香酸、丹酚酸A、丹参素。这将为如何构建丹酚酸组分生物药剂学评价提供基础。

[参考文献]

[1]贾晓斌， 陈彦， 李霞， 等 中药复方物质基础研究新思路和方法[J] 中华中医药杂志， 2008， 23（5）： 420

[2]顾俊菲， 封亮， 袁嘉瑞， 等 赤芍总苷、川芎总酚酸组分组成结构对缺氧损伤人脐静脉内皮细胞的影响[J] 中国中药杂志， 2015， 40（5）： 920

[3]邓翠娥 丹参的药理作用与临床应用研究进展[J] 时珍国医国药， 2003， 14（12）： 776

[4]赵洪芝， 王静， 姜民， 等 丹参总酚酸提取物 UPLC 指纹图谱及成分定性研究[J] 药物分析杂志， 2012， 32（4）： 620

[5]李佑生， 马宇滢， 王文健 丹酚酸的心血管系统药理作用研究进展[J] 中西医结合心脑血管病杂志， 2006， 4（9）： 791

[6]Joe Y， Zheng M， Kim H J， et al Salvianolic acid B exerts vasoprotective effects through the modulation of heme oxygenase1 and arginase activities[J] J Pharmacol Exp Ther， 2012， 341（3）： 850

[7]李萍， 周建良， 刘朋， 等 一种基于整体观评价中药活性和作用机理的方法： 中国， 101793883A[P] 20100804

[8]蒲丽娟， 刘义 对乙酰氨基酚对过氧化氢诱导的人脐静脉内皮细胞损伤的保护作用[J] 中国动脉硬化杂志， 2009， 17（9）： 714

[9]高蒙蒙， 孙桂波， 斯建勇， 等 红车轴草总黄酮对H2O2诱导的血管内皮细胞损伤的保护作用[J] 中国药理学通报， 2013， 29（2）： 201

[10]Huang P L eNOS， metabolic syndrome and cardiovascular disease[J] Trends Endocrinol Metab， 2009， 20（6）：295

[11]梁伟钧， 符益冰， 陈建英 冠心病患者血浆内皮素和肿瘤坏死因子含量变化及其临床意义[J] 心脏杂志， 2003， 15（2）： 137

[12]Ye Qing， Zheng Dagui， Chen Zongbao Rapid determination of paeonol in traditional Chinese medicinal preparations by microwaveassisted extraction followed by headspace solidphase microextraction and gas chromatographymass spectrometry[J] J Anal Chem， 2011， 66（3）： 285

[13]刘丹， 贾晓斌， 郁丹红， 等 基于中药组分的中药多元释药系统的构建[J] 中国中药杂志， 2012， 37（15）： 2338

[14]郁丹红， 刘丹， 贾晓斌， 等 基于组分层次的中药多元释药系统评价的构建[J] 中国中药杂志， 2012， 37（17）： 2667

[15]李佑生， 马宇滢， 王文健 丹酚酸的心血管系统药理作用研究进展[J] 辽宁中医学院学报， 2006，8（3）：41

[责任编辑马超一]