绿色木霉自絮凝固定化条件研究

邢欢，许文宗，李婕，徐仰仓，2，*（.天津科技大学海洋科学与工程学院，天津300457；2.天津市海洋资源与化学重点实验室，天津300457）



绿色木霉自絮凝固定化条件研究

邢欢1，许文宗1，李婕1，徐仰仓1，2，*
（1.天津科技大学海洋科学与工程学院，天津300457；2.天津市海洋资源与化学重点实验室，天津300457）

摘要：探究绿色木霉自絮凝固定化条件，以便提高其分泌纤维素酶的能力。首先测定固定化时间、体积、pH、葡萄糖与蛋白胨浓度对自絮凝固定化绿色木霉分泌纤维素酶的影响，然后用正交试验设计进行优化组合。时间、体积和pH对自絮凝绿色木霉分泌纤维素酶的影响均呈钟形曲线；葡萄糖对自絮凝绿色木霉分泌纤维素酶影响不大；蛋白胨对自絮凝绿色木霉分泌纤维素酶影响较大。绿色木霉自絮凝固定化最优条件是：时间为6 d，pH为6，体积为70 mL，葡萄糖为2.25%，蛋白胨为1.50%。按此条件培养自絮凝固定化的绿色木霉72h，分泌的纤维素酶活性为3.55 U。

关键词：自絮凝；正交试验；绿色木霉；纤维素酶

*通信作者

纤维素是地球上数量最大的可再生资源，占陆地生态系统生物量的80 %，每年通过全球生物合成可再生性纤维素达1 000亿t以上[1]。绿色木霉是产纤维素酶的高产菌株之一[2]，绿色木霉产生的纤维素酶对纤维素有降解作用，纤维素可以被降解为人类可直接利用的葡萄糖，以解决世界粮食问题；也可降解为乙醇，以解决世界能源问题；还可破坏植物细胞壁，以提高天然活性产物的提取率等。由于固定化细胞具有生长快、反应快、抗污染能力强、可连续使用、提高产品的转化率和生产效率，便于产物分离等特点，正越来越广泛地应用于食品与发酵工业中[3]，绿色木霉固定化技术的应用已经成为现在食品工业微生物研究的主要趋势之一[4]。优化与改进绿色木霉的固定化条件对于提高产纤维素酶活和延长产酶半衰期尤为重要[5]，而应用正交试验设计优化绿色木霉自絮凝固定化条件的研究还鲜见报道。为此，我们采用正交试验设计，以纤维素酶活为指标，对影响绿色木霉固定化的一些关键因素进行了研究与分析。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

1.1.1材料

绿色木霉（Trichoderma viride AS3.3711）购自中科院微生物研究所。

1.1.2仪器

752N 752紫外可见分光光度计：上海菁华科技仪器有限公司；TGL-16M高速台式冷冻离心机：湖南湘仪有限公司；2PG-280智能光照培养箱：黑龙江东拓仪器制造公司；SW-CJ-2FD超净工作台：上海博讯实业有限公司。

1.2方法

1.2.1绿色木霉自絮凝固定化

采用PDA固体培养基[6]培养绿色木霉，待表面长出绿色孢子后将其接入到PDA液体培养基中。PDA液体培养基中葡萄糖浓度为2.00 %，蛋白胨浓度为2.00 %，马铃薯浓度为20 %，温度为28℃，pH为自然，体积为70 mL，静态光照固定培养时间为5 d。

1.2.2纤维素酶活力测定

参照赵凯[7]的方法，略加改动，反应体系包括：0.5 mL酶液、1.5 mL柠檬酸缓冲液、3 mL DNS试剂，540 nm处测吸光度。根据还原糖的生成量计算酶活性，酶活力单位定义：发酵液在（50±0.1）℃，pH 4.8条件下，1 h水解滤纸底物，产生出相当于1 μmol葡萄糖的还原糖量，为1个酶活力单位，以U表示。

1.2.3单因素对绿色木霉自絮凝效果的影响

1.2.3.1固定时间对绿色木霉自絮凝的影响

葡萄糖浓度为2.00 %，蛋白胨浓度为2.00 %，pH为自然，培养体积为70 mL，固定化时间：5、6、7、8、9、10 d。研究时间对绿色木霉固定化的影响。

1.2.3.2固定pH对绿色木霉自絮凝的影响

葡萄糖浓度为2.00 %，蛋白胨浓度为2.00 %，培养体积为70 mL，固定化时间为6 d，pH：5、5.5、6、6.5、7、7.5。研究pH对绿色木霉固定化的影响。

1.2.3.3固定体积对绿色木霉自絮凝的影响

葡萄糖浓度为2.00 %，蛋白胨浓度为2.00 %，固定化时间为6 d，pH为6，培养体积：30、40、50、60、70、80 mL。研究体积对绿色木霉固定化的影响。

1.2.3.4葡萄糖对绿色木霉自絮凝的影响

蛋白胨浓度为2.00 %，固定化时间为6 d，pH为6，培养体积为70 mL，葡萄糖浓度：1.25 %、1.50 %、1.75 %、2.00 %、2.25 %、2.50 %。研究葡萄糖对绿色木霉固定化的影响。

1.2.3.5蛋白胨对绿色木霉自絮凝的影响

葡萄糖浓度为2.25 %，固定化时间为6 d，pH为6，培养体积为70mL，蛋白胨浓度：1.25%、1.50%、1.75%、2.00 %、2.25 %、2.50 %。研究蛋白胨对绿色木霉固定化的影响。

1.2.4正交试验设计

根据正交试验设计原理[8-9]，综合单因素试验结果，选取葡萄糖，蛋白胨，pH，体积，时间为试验因素。对各因素安排5个等间距浓度梯度，设误差列，按L25（56）正交设计表安排试验。测定纤维素酶活力，确定最优固定化条件。采用Excel和Latin软件对试验数据进行处理与分析。

2　结果与分析

2.1绿色木霉自絮凝固定化

绿色木霉在PDA液体表面按照三角锥形瓶的形状自絮凝形成圆形胶块。经测定自絮凝块的平均直径为5.4 cm，质量为0.42 g，培养液中纤维素酶的活性为2.55 U，绿色木霉自絮凝形态见图1。

图1　自絮凝固定化的绿色木霉Fig.1 Self-flocculating T.viride

2.2单因素对绿色木霉自絮凝效果的影响

2.2.1固定时间对绿色木霉自絮凝的影响

将50 mL发酵培养基倒入自絮凝的绿色木霉中，在28℃，110r/min下培养72 h。之后，利用滤纸酶活法测纤维素酶活性。固定时间对绿色木霉自絮凝的影响见图2。

图2　固定时间对酶活力的影响Fig.2 The effect of immobilization times on cellulase activity

由图2可知，随着时间的增长，纤维素酶活增高。在6 d时达到最大，但时间进一步增加时，纤维素酶活下降，可能是绿色木霉胶块表面菌丝退化所致。

2.2.2固定pH对绿色木霉自絮凝的影响

固定pH对绿色木霉自絮凝的影响见图3。

图3　固定pH对酶活力的影响Fig.3 The effect of pH on cellulase activity

由图3可知，随着pH增大，纤维素酶活增高，在6时达到最大。这是由于绿色木霉喜欢在偏酸性环境下生长。但pH继续增大，则纤维素酶活下降，试验发现pH偏高不利于绿色木霉进行自絮凝，所成胶块松散不完整。

2.2.3固定体积对绿色木霉自絮凝的影响

固定体积对绿色木霉自絮凝的影响见图4。

图4　固定体积对酶活力的影响Fig.4 The effect of immobilization volume on cellulase activity

由图4可知，随着体积增大，纤维素酶活先下降，到达50mL时最低，之后酶活性与体积成正比，在70mL时，酶活达到最高。但体积继续增大，则纤维素酶活下降。体积主要是影响营养物质的供给量，较少的营养供给使绿色木霉自絮凝形成的胶块较薄甚至使绿色木霉不能自絮凝成胶块，所以酶活较低。在较高体积时，胶块偏小导致酶活降低。

2.2.4葡萄糖对绿色木霉自絮凝的影响

葡萄糖对绿色木霉自絮凝的影响见图5。

由图5可知，随着葡萄糖的增加，纤维素酶活增高，在2.25 %时为最大。葡萄糖提供碳源，实验中供给的碳源越多，绿色木霉自絮凝成胶情况就越好，自絮凝胶块在发酵时所分泌的纤维素酶酶活就越高。

2.2.5蛋白胨对绿色木霉自絮凝的影响

蛋白胨对绿色木霉自絮凝的影响见图6。

图5　葡萄糖对酶活力的影响Fig.5 The effect of glucose on cellulase activity

图6　蛋白胨对酶活力的影响Fig.6 The effect of peptone on cellulase activity

由图6可知，随着蛋白胨增加，纤维素酶活增高，在1.50 %时达到最大。但pH继续增大，则纤维素酶活下降。观察发现蛋白胨浓度较低时，绿色木霉自絮凝成胶较好。蛋白胨浓度越高时，绿色木霉越难自絮凝且胶块成松散状态。

2.3绿色木霉自絮凝固定化产酶特性正交试验结果

为了确定5种因素的影响纤维素酶活顺序以及最优试验组合，根据单因素试验结果，按L25（56）正交设计表安排试验结果见表1，绿色木霉自絮凝固定化正交试验结果见表2。

表1　正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

表2　正交试验结果Table 2 Results of orthogonal test

续表2正交试验结果Continue table 2 Results of orthogonal test

由表2可知，5种因素中，对自絮凝绿色木霉产纤维素酶活性影响从大到小重要性排序依次为：蛋白胨浓度＞培养体积＞时间＞pH＞葡萄糖浓度。蛋白胨浓度对绿色木霉自絮凝形成胶块的影响较大，葡萄糖浓度的影响最低。根据正交试验结果确定最佳的固定化条件为：时间为6 d，pH为6.5，培养体积为70 mL，葡萄糖浓度为2.25 %，蛋白胨浓度为1.50 %。对比单因素试验，除了pH得到的最优条件不同，其它条件都相同。按照以上最优试验A1B3C4D4E1结果设计试验，进行3次自絮凝固定化绿色木霉产纤维素酶活力测定，所得样品的酶活力均值为3.55 U，绿色木霉自絮凝固定化正交试验方差分析结果见表3。

表3　方差分析结果Table 3 Results of variance analysis

由表3可知，当显著水平a=10%时，FD＞4.110，所以蛋白胨对自絮凝固定化绿色木霉产酶具有显著性影响，而其它因素的F值均小于4.110，所以没有显著性影响。

3　讨论与结论

经过单因素与正交试验方法得到自絮凝固定化绿色木霉的最优条件为：时间为6 d，pH为6.5，体积为70 mL，葡萄糖为2.25 %，蛋白胨为1.50 %。这些条件主要通过影响自絮凝胶块的大小及薄厚来影响纤维素酶活性。相比于没有优化之前，纤维素酶活性提高到原来的1.4倍。试验表明固定时间越长，PDA溶液中的绿色木霉由于缺少氧气停止生长，菌丝附着停止甚至退化死亡。pH偏高或偏低都不利于绿色木霉进行自絮凝，所成胶块松散不完整，因为绿色木霉在发生网结现象时[4]，自身会分泌物质增强绿色木霉粘连，pH过低或过高可能会对这种物质的合成产生抑制作用。因为绿色木霉是在PDA液体表面进行自絮凝的，越往上，三角瓶直径越小，所以酶活越低。葡萄糖作为碳源是微生物可以直接利用的营养物质，葡萄糖对绿色木霉自絮凝有一定的影响但影响不大。通过方差分析，当显著水平a=10%时，蛋白胨对自絮凝固定化绿色木霉产酶具有显著性影响。蛋白胨主要提供氨基酸。真菌能够分解自然界中的蛋白质变成可被吸收的氨基酸，真菌利用蛋白质能力是依赖其分泌蛋白酶分解大分子为较小基质的能力。因为绿色木霉菌丝之间需要聚集成胶从而才能分泌大量降解蛋白质的酶，所以少量的蛋白胨对绿色木霉自絮凝具有促进作用。但当蛋白胨过多时，具有底物反馈抑制作用，在一定程度上抑制了绿色木霉自絮凝。综上所述，本研究发现绿色木霉能进行自絮凝固定化，且经过发酵后，酶活性到达较高的水平，用自絮凝法固定化绿色木霉发酵产纤维素酶具有潜在的应用价值。

参考文献：

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[6]刘颖,张玮玮,王馥.绿色木霉产纤维素酶发酵条件的研究[J].食品工业科技,2008,203(3):128-130

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[9]高鹤永,弓爱君,曲冬梅,等.正交设计法优化Bt发酵培养基[J].现代农药,2004,3(5):11-12

Study on the Conditions of Trichoderma Viride Immobilized with Self-flocculation

XING Huan1，XU Wen-zong1，LI Jie1，XU Yang-cang1，2，*
（1.College of Marine Science and Engineering，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China；2.Tianjin Key Laboratory of Marine Resources and Chemistry，Tianjin 300457，China）

Abstract：Researching on the conditions of Trichoderma viride immobilized with self-flocculation，so we could get high cellulase activity.First，we measured the effects of time，volume，pH，glucose and peptone concentrations on cellulase activity of self-flocculating immobilized Trichoderma viride.Then we used the orthogonal test design to obtain optimized combinations.The times，volumes and pH had a bell shaped curve effect on cellulase activity of immobilized Trichoderma viride with self-flocculating.The glucoses had small effect on cellulase ac

tivity，but the peptone had great effect on cellulase activity.The best optimal conditions of self-flocculation of immobilized Trichoderma viride were 6 d of time，70 mL of volume，6 of pH，2.25 % of glucoses and 1.50 % of peptones.Under the optimized conditions，the cellulase activity could reach 3.55 U after Trichoderma viride for cultivating of 72 h.

Key words：self-flocculating；orthogonal test；Trichoderma viride；cellulase

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.05.031

基金项目：教育部留学回国人员科研启动基金（第44批）；天津市科技兴海项目（KJXH2012-14）

作者简介：邢欢（1989—），男（汉），研究生，研究方向：生物工程。

收稿日期：2014-11-27