虾壳甲壳素提取工艺优化及其辅助降血糖活性研究

孟凡欣，吴丽艳，徐盼菊，滕利荣，董媛（.吉林大学珠海学院，广东珠海5904；2.吉林医药学院，吉林长春3203）



虾壳甲壳素提取工艺优化及其辅助降血糖活性研究

孟凡欣1，吴丽艳1，徐盼菊1，滕利荣1，董媛2，*
（1.吉林大学珠海学院，广东珠海519041；2.吉林医药学院，吉林长春132013）

摘要：优化了虾壳中甲壳素提取工艺及其对糖尿病小鼠的影响。首先采用期望函数和响应面法优化了EDTA提取虾壳脱钙脱蛋白质工艺，并通过四氧嘧啶建立糖尿病小鼠模型，分别考察甲壳素、二甲双胍和二者联合给药1个月后，糖尿病小鼠的体重、血糖等指标的变化。最终确定最佳提取工艺为：EDTA脱钙条件pH 11，EDTA浓度11 %，反应时间2 h，料液比1∶14（g/mL），之后过滤，烘干，双氧水脱色，烘干，既得甲壳素提取物。验证试验与预测值相对误差为2.8 %，较优化前提高了20.3 %。降血糖结果显示，与模型组，或是甲壳素和二甲双胍单独给药组相比，二者联合给药能够缓解小鼠体重下降（P＜0.05），显著降低糖尿病小鼠的血清总胆固醇、甘油三酯、血糖、糖化血红蛋白含量（P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01），增加胰岛素表达（P＜0.05）。也能缓解对胰腺组织的损伤（P＜0.05）。甲壳素能够增强二甲双胍的抗糖尿病功效，在临床上应用有重要的意义。

关键词：期望函数；响应面；甲壳素；二甲双胍；糖尿病；四氧嘧啶

甲壳素（chitin），又名甲壳质，几丁质，是从甲壳动物外壳中提取出来的一种氨基多糖[1]。在自然界中资源丰富，是除蛋白质外数量最多的含氮天然高分子化合物[2]。自1811年首次被发现以来，甲壳素及其衍生物在食品、医药、环境等多个领域都有广泛应用，具有抗癌、抗感染、提高机体免疫力等多种功效[3-4]。然而市场上销售的甲壳素作为保健品，往往被消费者滥用，不能合理、科学的使用。此外，传统的提取方法多采用酸碱法，不仅容易破坏甲壳素的结构，且污染环境，所以本研究希望通过满意度函数和响应面法优化EDTA代替强酸强碱提取甲壳素的工艺，同时，为了考察甲壳素降血糖的辅助治疗作用，采用四氧嘧啶诱导糖尿病小鼠动物模型，探讨甲壳素辅助二甲双胍（一种常规糖尿病治疗药物）在降糖、降血脂等领域的预防及治疗效果，如果能够通过药物控制血糖，将大大减少由于注射胰岛素等方式给患者带来的痛苦，具有重要的意义。

1　材料与方法

1.1仪器与材料

虾：购于长春市光复路水产市场，将整虾洗净后，剥去虾仁，将虾壳和虾头等，清洗烘干后备用；ELX800型酶标仪：美国BIOTEK有限公司；昆明钟小鼠（清洁级，18～22 g，雄性）：购自吉林大学医学部实验动物中心，许可证号SCXK（吉）2013～0003；四氧嘧啶、二甲双胍、柠檬酸、EDTA等试剂：美国Sigma公司；葡萄糖（GLU）、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、糖化血红蛋白（GHb）、胰岛素（Ins）测定试剂盒：南京建成生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1甲壳素的提取工艺研究

1.2.1.1工艺流程

虾壳样品预处理→EDTA脱钙脱蛋白→过滤→烘干→双氧水脱色→水洗→烘干

1.2.1.2样品预处理

洗净烘干后的虾壳样品经粉碎机粉碎，过40目筛，备用。

1.2.1.3甲壳素的提取

精确称取10 g虾壳粉，浸泡于一定pH的EDTA溶液当中，30℃恒温水浴中搅拌一定时间，直至脱去虾壳粉中的钙和蛋白质，过滤，留取滤渣，50℃烘干至恒重，浸泡于10 %过氧化氢溶液中脱色2 h，直至滤渣变为白色粉末，即为甲壳素。甲壳素得率/%=甲壳素质量/虾壳粉质量×100。

1.2.1.4蛋白质含量测定

凯氏定氮法检测样品提取前后蛋白质含量[5]。脱蛋白质率/ %=（提取前蛋白质含量-提取后蛋白质含量）/提取前蛋白质含量×100。

1.2.1.5钙含量测定

根据GB/T 6436-2002《饲料中钙的测定》测定样品提取前后的钙含量。脱钙率/ %=（提取前钙含量-提取后钙含量）/提取前钙含量×100。

1.2.1.6期望函数

通过期望函数，可以将多个指标转化为一个无量纲的指标，即期望值（Dv）。本试验将期望函数定义如下：

其中：Yi代表的是第i个考察指标的试验所得响应值；yi是人为设定的第i个考察指标的最低响应值；Li是第i个考察指标设定的最高响应值；di是第i个考察指标的期望值。当每一个考察指标均被转化为di后，将其组合成一个Dv值，代表总体的期望值，Dv被定义为：

wi是每一个考察指标的权重值，反映的是不同响应值在重要性上的差别；n是考察变量的总数[6]。本试验的期望函数参数如表1所示。

表1　期望函数各参数表Table 1 The parameters of the desirability function in currentstudy

1.2.1.7响应面法优化甲壳素提取工艺

采用四因素三水平试验设计表（表2），以期望值（Dv）为指标，优化虾壳中甲壳素提取工艺，并通过Design-expert8.0.6进行ANOVA统计学分析[7]。

表2　响应面试验因素水平表Table 2 Independent variables and their levels in the Box-Behnken design

1.2.1.8验证试验

对响应面预测最优结果进行3次平行试验，验证其提取效果。

1.2.2甲壳素辅助治疗糖尿病的实验观察

1.2.2.1糖尿病小鼠模型的建立、分组及给药

参照文献[8-9]的方法，选取健康小鼠，禁食不禁水16 h，腹腔注射四氧嘧啶溶液（150 mg/kg，溶于生理盐水，现用现配）。于注射后3 h灌胃给予25 %葡萄糖1 mL/100g。24h后重复此过程1次。建模72 h后，眼静脉丛采血，测定空腹血糖浓度，其中血糖浓度高于16.7mmol/L的小鼠被视为造模成功小鼠。将造模成功小鼠随机分成4组，每组10只，Ⅰ组灌胃给药二甲双胍（60 mg/（kg·d），Met），饲喂基础饲料；Ⅱ组灌胃给药60 mg/（kg·d）二甲双胍，饲喂甲壳素饲料（10 %甲壳素，90 %基础饲料）；Ⅲ组灌胃同等体积的生理盐水，饲喂甲壳素饲料；Ⅳ组灌胃同等体积的生理盐水，饲喂基础饲料，作为模型组（DM）。并随机选取10只健康小鼠作为空白对照组（CT）。

1.2.2.2口服糖耐量实验

末次给药后，按照参照文献[8]考察各组糖尿病小鼠口服糖耐量实验，观测小鼠口服葡萄糖之后0.5 h，1 h和2 h血糖值。并按照（3）计算血糖曲线下面积（AUC）。

AUC/（mmol/L·h）=（0 h血糖值+ 0.5 h血糖值）× 0.25+（0.5h血糖值+1h血糖值）×0.25+（1h血糖值+2h血糖值）×0.5（3）

1.2.2.3生化指标测定

给药30 d期间，每10天记录1次各组小鼠体重。末次给药后，禁食不禁水12 h，眼静脉丛采血，采用试剂盒测定血清中TC、TG、GLU、GHb、Ins含量。

1.2.2.4脏器指数测定

处死前称量体重，脱臼处死后立即取出心、肝、脾、肺、肾、胰腺6种脏器，除去污血，滤纸擦干后置于电子天平上称量脏器的重量，脏器指数以脏器重量（g）与体重（g）之比表示。

1.2.3统计学分析

数据用均值±SD表示，采用origin 8.0软件进行变异数分析，以t检验进行显著性分析。P＜0.05被认为是具有显著差异。

2　结果与分析

2.1提取工艺

2.1.1响应面结果

四因素三水平BBD试验设计表格如表3所示，ANOVA方差分析如表4所示。

对实验结果进行ANOVA分析后，得到一个多元二次回归方程来拟合实验结果：

Y=+0.75+0.029A+0.03B-0.005C+0.17D-0.028AB-0.028AC-0.072AD-0.007BC+0.02BD-0.025CD-0.09A2-0.1B2-0.1C2-0.12D2（3）

该模型的F检验为26.4，P值小于0.05，R2= 0.973 7，说明模型具有很好的拟合度，二次回归模型显著。而A、B、D、AD、A2、B2、C2、D2项P值均小于0.05，说明对响应值影响显著，尤其pH和料液比交互作用显著。三维图显示，pH和料液比等高线为椭圆型，且直径线与坐标轴存在一定角度，与统计分析结果一致（图1），能更直观地显示各个因素之间的交互作用。优化后得到虾壳中甲壳素提取的最佳工艺为：EDTA脱钙条件pH 11，EDTA浓度11 %，反应时间2 h，料液比1∶14（g/mL），之后过滤，烘干，双氧水脱色，烘干，既得甲壳素提取物。预测的最大Dv值对应的甲壳素最大干重为2.52g，脱钙率为85%，脱蛋白率为94%。验证试验提取的平均甲壳素干重为2.57 g，与模型的预测值相对误差为2.8%，较未优化提取工艺时提高了20.3%。

表3　四因素三水平BBD试验设计表格Table 3 The design matrix generated for the BBD and the obtained response values

表4　响应面方差分析Table 4 ANOVA analysis for Response Surface Quadratic Model

图1　响应面优化交互作用图Fig.1 The interaction effect of response surface method

2.2降血糖实验结果

2.2.1糖耐量试验

糖耐量实验能够反应糖尿病患者对血糖的调节能力，实验结果如图2所示。

从图2中可以看出，二甲双胍和甲壳素联合给药后，糖尿病小鼠AUC面积低于二甲双胍或者甲壳素单独给药组的AUC面积，且与模型组有显著差异（P＜0.01）。

2.2.2小鼠体重实验结果

各组糖尿病小鼠体重结果如表5所示。

图2　糖尿病小鼠口服糖耐量实验结果Fig.2 Results of oral glucose tolerance test in diabetic mice注：DM与CT组比较，##P＜0.01；与DM组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

表5　各组糖尿病小鼠体重监测结果（n=10）Table 5 Body weight of diabetic mice（n=10）

由表5可知，甲壳素辅助二甲双胍给药30 d后，糖尿病小鼠体重降低有所缓解，与模型组相比，存在显著差异（P＜0.05），与二甲双胍或者甲壳素单独给药组小鼠体重相近。

2.2.3生化指标检测结果

各组糖尿病小鼠各项血液生化指标检测结果如表6所示。

表6　各组糖尿病小鼠血液生化检测结果（n=10）Table 6 Biochemical values of of diabetic mice（n=10）

由表6可知，模型组糖尿病小鼠血清TG、TC、GLU、Ins、GHb均与正常对照组存在显著差异（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01），表现出糖尿病典型的高血脂、高血糖，糖化血红蛋白水平及胰岛素水平异常等症状。甲壳素辅助二甲双胍给药后，与模型组相比，能够显著降低糖尿病小鼠TG、TC、GLU水平（P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01），使其恢复到接近正常范围内。同时，糖化血红蛋白和胰岛素水平虽没有完全恢复到正常值，但与模型组相比，胰岛素水平有所提高（P＜0.05）糖化血红蛋白水平有所下降（P＜0.05）。且对糖尿病小鼠的降血糖、降血脂效果优于二甲双胍或甲壳素单独给药。

2.2.4脏器指数结果

脏器指数结果如表7所示。

表7　各组糖尿病小鼠脏器指数结果（n=10）Table 7 Organ indices of diabetic mice（n=10）

模型组小鼠心脏、肝脏、肺3种脏器指数与正常组没有差异（P＞0.05），可能是由于四氧嘧啶建模时间短，小鼠还没有出现心、肝和肺组织的明显肿大，而脾指数、肾指数和胰腺指数却与正常对照组存在显著差异（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01），说明存在脾、肾和胰腺的损伤或肿大。甲壳素与二甲双胍联合给药后，对糖尿病小鼠的胰腺有一定的保护作用，与模型组存在差异（P＜0.05）。

3　结论

甲壳素，作为天然高分子材料，对人、畜、农作物无任何副作用，在日本已经用于制成保健品[10]。本文采用期望函数和响应面法优化了EDTA处理虾壳提取甲壳素的工艺，较未优化提取工艺时甲壳素产量提高了20.3 %。随后研究了甲壳素和降糖药二甲双胍联合给药对糖尿病小鼠的影响，结果显示甲壳素能增强二甲双胍的降糖、降脂效果，体现在能够缓解糖尿病导致的体重减轻（P＜0.05），同时，降血糖、降血脂效果比单独使用二甲双胍或者甲壳素时效果更好，血脂和血糖恢复到正常水平。糖耐量实验和糖化血红蛋白的检测能够体现患者对血糖的调节能力和近期的血糖水平，对二者的研究发现，甲壳素联合二甲双胍给药后，能够在口服葡萄糖2h内恢复正常血糖值，且糖化血红蛋白水平也接近正常值，效果优于单独给药，与模型组存在显著差异（P＜0.01，P＜0.01）。改善胰岛素表达水平和对胰腺、肾等脏器的损伤。通过实验观察，甲壳素可以和降糖药联合给药，增强降糖药的降糖、降脂效果。

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Optimization of the Extraction Process of Chitin from Shrimp Shell and Its Anti-diabetic Activity

MENG Fan-xin1，WU Li-yan1，XU Pan-ju1，TENG Li-rong1，DONG Yuan2，*
（1.Zhuhai College，Jilin University，Zhuhai 519041，Guangdong，China；2.Jilin Medical University，Changchun 132013，Jilin，China）

Abstract：In order to extract chitin from shrimp shell and investigate it's hypoglycemic effect，response surface method and desirability function were applied to optimism the extraction process of chitin from shrimp shell.Then the hypoglycemic effect of chitin was studied.The diabetic mice model was established by using alloxan.After one month's treatment，the hepoglycemic effects of chitin，metformin and chitin combined with metformin on the body weight，blood glucose and so on were studied.The optimum extraction condition of chitin was as follow：pH 11，EDTA concentration 11 %，reaction time 2 h，solid-liquid ratio 1∶14（g/mL），after filtration，drying，hydrogen peroxide bleaching and drying，vested chitin extract.Compared verification tests with the model predictive value，the relative error was 2.8 % which was improved by 20.3 %.The hypoglycemic results showed that，compared with the model group，or the chitin and metformin alone，the combination of the two drugs could relieve the weight loss of mice induced by diabetes mellitus（P＜0.05），and the serum total cholesterol，triglyceride，blood glucose levels were significantly reduced（P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01）.The insulin expression increased（P＜0.05）.The mouse organ index showed that the combined administration of chitin and metformin could also relieve the damage to the pancreas tissue（P＜0.05）.Chitin can enhance the efficacy of metformin in lowering blood glucose and blood lipid，and it has important significance in clinical application.

Key words：desirability function；response surface method；chitin；metformin；diabetes；alloxan

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.05.023

基金项目：《吉林大学珠海学院“三个层次”师资骨干队伍建设》项目（E201421）

作者简介：孟凡欣（1981—），男（汉），讲师，博士，研究方向：生物制药。

*通信作者：董媛（1986—），女，讲师，博士，研究方向：生物制药。

收稿日期：2015-11-18