曼陀罗总生物碱提取的工艺优化

尚天翠，卫刚，刘影（.伊犁师范学院自治区教育厅普通高等学校重点实验室，新疆伊宁835000；.新疆伊宁卫生学校专业基础学科，新疆伊宁835000）



曼陀罗总生物碱提取的工艺优化

尚天翠1，卫刚2，刘影1
（1.伊犁师范学院自治区教育厅普通高等学校重点实验室，新疆伊宁835000；2.新疆伊宁卫生学校专业基础学科，新疆伊宁835000）

摘要：采用乙醇回流法提取曼陀罗总生物碱，并对提取条件进行优化。首先采用单因素试验考察料液比、提取时间、提取温度、pH等因素对曼陀罗总生物碱提取效果的影响，再以此四因素进行L9（34）正交试验以确定最佳工艺条件。结果表明：曼陀罗中总生物碱的最佳提取工艺条件为提取温度60℃、提取时间2 h、提取剂乙醇浓度75 %、料液比1∶15（g/mL）。

关键词：曼陀罗；总生物碱；提取

曼陀罗（Datura stramonium L.）又称醉心花、洋金花等，为茄科曼陀罗属植物。我国各省区均产，常生于村边、路边和草地，含生物碱、黄酮、多糖、亚油酸等多种有效成分[1-5]，其中有效成分主要为生物碱，具有治疗关节痛、哮喘、咳嗽、胃肠痉挛、神经性偏头痛、跌打损伤等症[6-9]。现代医学和临床研究发现，曼陀罗具有多种生物活性，医学上可广泛应用于多种疾病的治疗以及农林业上对多种病虫鼠害的防治[10-13]。

我国曼陀罗资源丰富，价廉易得，为可开发的天然药用植物资源。本研究采用索氏回流法提取曼陀罗中总生物碱，通过L9（34）正交试验对曼陀罗总生物碱的最佳提取工艺条件进行了优化，旨在寻求一种快速、简便、高效、对工业生产有参考价值的提取曼陀罗中总生物碱的方法。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

曼陀罗植株在2010年9月采集于伊宁市上海城周边地区。将新鲜植株剪去叶片、花果枝和根，剩余茎杆用蒸馏水冲洗干净。经60℃烘干后粉碎，过40目筛，装入塑封袋中低温保存备用。

无水乙醇、碘化铋钾、溴水、浓硫酸、镁粉、α-萘酚、硫酸钠、甲醇、乙酸镁、浓硫酸、甲醛均为国产分析纯。

1.2仪器与设备

0.1mg～220 g电子天平：北京赛多利斯系统仪器有限公司；FW-80高速万能粉碎机；8401—2A型数显远红外高温干燥箱：杭州蓝天化验仪器厂；，HH-S8电热恒温水浴锅：常州国华电器有限公司；UV-2600PC紫外分光光度计：上海舜宇恒平科学仪器有限公司。

1.3方法

1.3.1曼陀罗生物碱的提取工艺流程

新鲜曼陀罗→烘干→粉碎→提取→浓缩→酸水溶解→碱化→萃取→稀释→鉴定→测吸光度

1.3.2生物碱提取液的鉴定

生物碱在中性或酸性条件下，与某些沉淀试剂反应生成弱酸不溶性复盐或络合物沉淀[14]，生物碱的沉淀反应能对曼陀罗生物碱进行灵敏检测，本试验通过沉淀反应和显色反应对提取液进行定性分析。

将曼陀罗提取液分装入6个试管分别用碘化铋钾、溴水、甲醛-浓硫酸、1 %乙酸镁甲醇、5 %α-萘酚乙醇溶液等试剂鉴定[15-16]。

1.3.3最大吸收峰波长的确定

称取2 g粉碎的曼陀罗粉末，在提取温度为60℃的条件下，用30 mL 75 %乙醇溶剂回流提取2 h，浓缩，将上述浓缩液加水50 mL，加热溶解并调pH为2～3，过滤，氨试液碱化，用氯仿提取3次，回收氯仿稀释500倍后在紫外分光光度计上进行全波段扫描，以乙醇溶液为对照试验，确定其最大吸收波长。

1.3.4单因素试验

1.3.4.1提取温度筛选

称取2 g曼陀罗粉末，共5份，分别放入50 mL的回流瓶中，编号，再分别加入30 mL 75 %的乙醇，分别于40、50、60、70、80℃的条件下回流提取2 h，浓缩，将上述浓缩液加水50 mL，加热溶解并调pH为2～3，过滤，氨试液碱化，用氯仿提取3次，回收氯仿稀释后，在249.80 nm处测其吸光度。

1.3.4.2提取时间筛选

称取2 g曼陀罗粉末，共5份，分别放入50 mL的回流瓶中，编号，再分别加入30 mL 75 %的乙醇，在60℃条件下分别回流提取0.5、1、1.5、2、2.5 h，浓缩，将上述浓缩液加水50 mL，加热溶解并调pH为2～3，过滤，氨试液碱化，用氯仿提取3次，回收氯仿稀释后，在249.80 nm处测其吸光度。

1.3.4.3提取剂乙醇浓度筛选

称取2 g曼陀罗粉末，共5份，分别放入50 mL的回流瓶中，编号，再分别加入30 mL 45 %、55 %、65 %、75 %、85 %的乙醇，60℃条件下回流提取2 h，浓缩，将上述浓缩液加水50 mL，加热溶解并调pH为2～3，过滤，氨试液碱化，用氯仿提取3次，回收氯仿稀释后，在249.80 nm处测其吸光度。

1.3.4.4料液比筛选

称取2 g曼陀罗粉末，共5份，分别放入50 mL的回流瓶中，编号，再分别加入75 %的乙醇10、20、30、40、50 mL，在60℃条件下回流提取2 h，浓缩，将上述浓缩液加水50 mL，加热溶解并调pH为2～3，过滤，氨试液碱化，用氯仿提取3次，回收氯仿稀释后，在249.80 nm处测其吸光度。

1.3.5正交试验优化提取条件

为了优化提取工艺，根据提取过程中的影响因素，考虑乙醇浓度、料液比、提取时间、提取温度4个因素，在单因素试验基础上，选择L9（34）进行正交试验，正交试验因素水平见表1。以总生物碱稀释液的吸光度值为考察指标，确定最佳提取工艺条件。

表1　正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels for orthogonal array design

1.3.6.1对照品溶液的制备

精密称取硫酸阿托品5 mg，加水溶解，制成每1 mL 含0.05 mg的标准品溶液。

1.3.6.1标准曲线的制备

精密吸取上述对照品混合溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL分别置于20 mL试管中，各加0.05%溴百里香酚蓝溶液3.0 mL，加水补至10 mL，分别再加入10 mL氯仿溶液，振摇1min后，倒入分液漏斗中静置1 h，分取氯仿层，以未加对照品的氯仿萃取液为空白，在249.8 nm处测吸光度，以生物碱含量为横坐标，吸光度为纵坐标，做标准曲线，得线性回归方程为y=0.619 3x+ 0.060 5（R2=0.999 8）。

1.3.7总生物碱含量计算

2　结果与分析

2.1生物碱提取液鉴定结果

生物碱提取液鉴定结果见2。

用碘化铋钾、溴水、浓硫酸、镁粉、1 %乙酸镁甲醇、5 %α-萘酚乙醇溶液等试剂鉴定，反应现象如表2所示。根据显色反应和沉淀反应可对提取液进行定性分析，反应现象表明提取液中含有生物碱。

表2　试管法鉴定结果Table 2 Identification results by test tube method

2.2最大吸收峰波长的确定结果

曼陀罗总生物碱的紫外吸收光谱见图1。

图1　曼陀罗总生物碱的紫外吸收光谱Fig.1 UV absorption spectrum of Datura stramonium L.total alkaloid

由图1可知，以乙醇溶液为对照试剂，曼陀罗提取液在紫外分光光度计上全波段扫描后，在245 nm～295 nm的波长范围内出现波峰，且249.8 nm处吸光度值最大，295 nm～395 nm之间吸光度值较平稳，395 nm后吸光度值逐渐减小，因此，确定249.80 nm为生物碱提取液最大吸收峰波长。

2.3单因素试验结果

2.3.1提取温度对提取效果的影响

提取温度对OD249.80nm的影响见图2。

图2　提取温度对OD249.80nm的影响Fig.2 Effect of extraction temperature on OD249.80nm

由图2可知，当温度在30℃～60℃之间时，曼陀罗总生物碱的提取效果随温度升高而逐步升高，60℃时提取效果达到最大。温度超过60℃时，提取效果开始缓慢下降，可能因为温度升高生物碱分解，降低了生物碱的提取效果。因此，本试验选择提取温度60℃为宜。

2.3.2提取时间对提取效果的影响

提取时间对OD249.80nm的影响见图3。

图3　提取时间对OD249.80nm的影响Fig.3 Effect of extraction time on OD249.80nm

由图3可知，当提取时间由0.5 h上升到1.0 h时，提取效果迅速增加，而提取时间由1.5 h上升到2.5 h时，随着时间的变化，提取效果平稳增加，这说明在2 h内生物碱在固液之间的传质达到了平衡，而且提取时间过长，乙醇挥发，杂质成分溶解也随之增加。因此，本试验选择提取时间2 h为宜。

2.3.3提取剂乙醇浓度对提取效果的影响

提取剂乙醇浓度对OD249.80nm的影响见图4。

图4　提取剂乙醇浓度对OD249.80nm的影响Fig.4 Effect of alcohol concentration on OD249.80nm

由图4可知，当提取剂乙醇浓度在45 %～75 %之间时，曼陀罗总生物碱的提取效果随乙醇浓度的增加逐渐增大，当增加到75 %时提取效果达到最大，在85 %时反而下降。因此，本试验选择75 %乙醇为宜。

2.3.4料液比对提取效果的影响

料液比对OD249.80nm的影响见图5。

由图5可知，当料液比在1∶5（g/mL）～1∶15（g/mL）之间时，曼陀罗总生物碱的提取效果随料液比的减小逐渐增大，料液比为1∶15（g/mL）时提取效果达到最大；此后提取效果随料液比的减小而逐渐下降。因此，本试验选择料液比1∶15（g/mL）为宜。

图5　料液比对OD249.80nm的影响Fig.5 Effect of material/liquid ratio on OD249.80nm

2.4正交试验结果

2.4.1正交试验结果分析

正交试验设计及结果见表3，正交试验方差分析结果见表4。

表3　L9（34）正交试验设计及结果Table 3 L9（34）orthogonal array design and results

表4　方差分析结果Table 4 Results of variance analysis

由表3的K及R（极差）值分析可知，影响回流法提取曼陀罗提取效果的因素次序为A＞B＞D＞C，即提取温度＞提取时间＞料液比＞提取剂乙醇浓度，最佳工艺组合为A2B2C2D2。由表4方差分析可知，其中提取温度对曼陀罗总生物碱提取效果的影响是显著的，而提取时间、提取剂乙醇浓度和料液比对曼陀罗总生物碱提取效果的影响均不显著，说明提取温度是主要的影响因素。因此，曼陀罗生物碱提取的最佳工艺条件为A2B2C2D2即温度60℃、时间2 h、乙醇浓度75 %、料液比1∶15（g/mL）。

2.4.2正交试验结果验证

为了验证上述结果的准确性，重复提取A2B2C2D2，得总生物碱的含量为0.477 %。结果表明试验结果总生物碱含量明显高于正交设计的9个试验号。因此，证明优选出的最佳工艺合理可行，其选择结果是可信的。

3　结论

本试验采用回流法提取曼陀罗总生物碱，通过L9（34）正交试验对曼陀罗总生物碱的最佳提取工艺条件进行了优化。结果表明，影响曼陀罗总生物碱提取效果各因素的主次顺序为最佳提取工艺为：提取温度＞提取时间＞料液比＞提取剂乙醇浓度；最佳提取条件为：提取温度60℃、时间2 h、提取剂乙醇浓度75 %、料液比1∶15（g/mL）。

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Optimization of Extraction Technology of Datura stramonium L.Total Alkaloids

SHANG Tian-cui1，WEI Gang2，LIU Ying1
（1.Key Laboratory at Universities of Education Department of Xinjiang Uygur Autonomous Region，Yili Normal University，Yining 835000，Xinjiang，China；2.The Professional Foundation Course，Xinjiang Yining Health School，Yining 835000，Xinjiang，China）

Abstract：The extraction process for Datura stramonium L.total alkaloids by the method of alcohol refluxing was optimized.Four process conditions including extraction temperature and time，alcohol concentrationand，solid/solvent ratio were investigated for their effect on the extraction efficiency of Datura stramonium L.total alkaloids and optimized using an L9（34）orthogonal array design.Results showed that the optimal extraction conditions were extraction temperature of 60℃，extraction time of 2 h，alcohol concentration 75 %，and solid/ solvent ratio of 1∶15（g/mL）.

Key words：Datura stramonium L.；total alkaloid；extraction

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.05.020

基金项目：伊犁师范学院/自治区教育厅普通高等学校重点实验室项目（2013YSHXYB09）

作者简介：尚天翠（1979—），女（汉），高级实验师，硕士，主要从事植物与微生物资源开发研究。

收稿日期：2014-11-26