移植NEP基因转染的神经干细胞对AD大鼠行为学的影响①

柳朝阳，陆宏军，荣光影，张　涛，孙法明

(佳木斯大学，黑龙江佳木斯154007)



移植NEP基因转染的神经干细胞对AD大鼠行为学的影响①

柳朝阳，陆宏军，荣光影，张涛，孙法明

(佳木斯大学，黑龙江佳木斯154007)

关键词:NEP基因;神经干细胞; AD大鼠

阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)病理过程的关键问题是患者脑中β－淀粉样多肽(Aβ)的异常增加和沉积［1］。中性内肽酶(NEP)是脑内最重要的Aβ降解酶，是影响脑内Aβ分解代谢速率的限制因素［2］。神经干细胞(neural stem cell，NSC)是具有向多种细胞系分化又具有自我更新能力的细胞［3］。NSCs治疗AD是运用其特性修复和替代受损的神经细胞，另外，NSCs是非常理想的基因载体，拥有许多其他载体所没有的优点。本实验将NEP基因转染的神经干细胞移植到AD大鼠侧脑室，观察行为学的变化，为阿尔茨海默病的治疗提供新的依据。

1　材料和方法

1.1实验动物

清洁SD大鼠由佳木斯大学动物实验中心提供。

1.2主要试剂

胎牛血清、Aβ1－40、神经干细胞基础培养基、神经干细胞完全培养基、神经小球分散试剂盒等均购于美国Sigma公司。

1.3方法

1.3.1动物模型的建立［4］

选左侧海马CAI区为注射区:根据Pellegrino和Cusmhna的大鼠脑立体定位图谱，确定本研究中的注射坐标为前囱后3.3mm，中线左侧2.2mm，硬脑膜下2.8mm。用微量加样器缓慢注射Aβ－40溶液1μL，之后缓慢撤针，充分消毒，缝合皮肤。术后常规饲养，待两周后做细胞移植。

1.3.2分组和细胞移植

30只AD大鼠在随机分为3组，每组各10只: AD模型组、移植神经干细胞组(NSCs组)和移植NEP基因转染神经干细胞组(NEP－NSCs组)。选左侧海马CAI区在3组AD大鼠分别微量植入6μL细胞培养液、NSC悬液及NEP－NSC悬液(浓度约为1×105个细胞/μL)，注射完毕后，全层缝合头皮，腹腔注射青霉素，术后放置于温暖安静处至清醒。每组大鼠术后第8周进行实验。

1.3.3隐蔽平台实验［5］

实验期限为6d。实验前让大鼠自由游泳1分。在水迷宫象限的中央固定隐蔽平台的位置，将每只大鼠头朝外壁在任何一个象限内的随机位置放入水中，大鼠爬到平台上或到达60秒时，实验立即停止。大鼠自己爬到平台或操作人员引导使其爬上平台后停留10秒。每天训练4次，每次间隔30min。通过影像系统记录大鼠寻找并爬上平台所需时间即逃避潜伏期。此实验用于测量动物在水迷宫中的学习和记忆能力。

1.3.4空间探索实验

第7天在水迷宫中撤除平台，将动物在任意一个入水点将放入水中，检测60秒时间内，大鼠出现在目标象限(target quadrant，TQ)的百分比。此实验用来检测动物保持记忆能力。

1.4统计学方法

采用SPSS 11.3软件分析，各组间统计分析应用t检验。实验数据以珋±s表示。

2　结果

2.1行为学测试

与AD模型组相比，NEP－NSCs组和NSCs组的AD大鼠在第4、5、6天的平均潜伏期均明显缩短(P＜0.05)，以NEP－NSCs组尤为明显，且NEPNSCs组的AD大鼠在第4、5、6天的平均潜伏期亦明显比NSCs组缩短(P＜0.05)。

表1　各组大鼠在移植术后第8周的隐蔽平台实验1～6d的平均潜伏期(珋±s，n =10)

表1　各组大鼠在移植术后第8周的隐蔽平台实验1～6d的平均潜伏期(珋±s，n =10)

注:与AD模型组比较a)P＜0.05;与NSCs组比较b)P＜0.05。

1d　2d　3d　4d　5d　6d AD模型组　32.43±15.72　 28.22±20.71　 28.29±13.91　 26.03±8.91　 22.76±11.75　 17.64±6.02 NSCs组　30.51±13.82　 26.61±17.91　 24.67±10.94　 21.46±5.19a)　17.43±5.69a)　14.15±2.04a)NEP－NSCs组　28.43±12.72　 23.75±14.96　 21.59±1.89　 14.61±3.07a) b)　12.62±3.32a) b)　10.61±1.03a) b)

2.2空间探索实验

与AD模型组相比，NSCs组和NEP－NSCs组AD大鼠在目标象限探索时间的百分比有所增加，以NEP－NSCs组明显，但无统计学差异(P＞0.05)。

表2　各组大鼠在探索实验中在TQ象限中搜索时间所占百分比(x珋±s，n =8)

3　讨论

本实验中Aβ海马CAI区微量注射制备AD大鼠模型，将NEP基因转染的神经干细胞移植到AD模型大鼠侧脑室区，通过隐蔽平台获得实验和空间搜索实验评价NEP基因转染对AD大鼠学习记忆的影响。实验结果显示:隐蔽平台获得实验中，与AD模型组相比，NEP－NSCs组和NSCs组在第4、5、6天的平均潜伏期均明显缩短(P＜0.05) ;与NSCs组相比，NEP－NSCs组第4、5、6天的平均潜伏期亦明显缩短(P＜0.05)。这表明NEP－NSCs组和NSCs组均能显著改善AD大鼠的学习和记忆功能。空间探索实验中，与AD模型组相比，NEPNSCs组和NSCs组在TQ象限搜索时间的百分比有所增加，但无统计学意义。水迷宫实验表明，海马移植了转染NEP基因的神经干细胞后，可以明显改善AD大鼠的学习和记忆功能，原因是由于海马移植了转染NEP基因的的神经干细胞后，可以高表达NEP蛋白，NEP蛋白是Aβ降解酶，因此可以减少Aβ在皮层及海马区的沉积，降低了Aβ对神经系统的毒性作用。从而改善和提高了AD大鼠的学习和记忆功能。

参考文献:

［1］Debora D，Jean－Paul N.Proteomic analysis of cerebrospinal fluid from multiple sclerosis patients［J］.Proteomics，2004，4: 2117－2124

［2］Wasinger V C，Cordwell S J，Cerpa－Poljak A，et al.Progresswith gene－product mapping of the Mollicutes: Mycoplasma gen－italium ［J］.Electrophoresis，1995，16(7) : 1090－1094

［3］张维烨，李艳君，陈立强.神经干细胞分化研究进展［J］.黑龙江医药科学，2005，28(3) : 89－90

［4］朱飞奇，马英，钱采韵.大鼠海马立体定向注射Aβ 1－40建立阿尔茨海默病动物模型［J］.郧阳医学院学报，2008，28(2) :106－108

［5］李萍.阿尔茨海默氏病大鼠模型的建立及行为学评价［J］.宁波大学学报，2011，24(2) : 103－106

(收稿日期:2016－02－02)

通讯作者:张涛(1971～)女，黑龙江佳木斯人，博士，教授，硕士研究生导师。E－mail: ztlzy1971@163.com。

作者简介:柳朝阳(1971～)男，黑龙江佳木斯人，硕士，副主任医师。

基金项目:①1.黑龙江省卫生厅科研项目，编号: 2009－336; 2.黑龙江省普通高等学校青年学术骨干支持计划项目，编号: 1252G059 ; 3.黑龙江省自然科学基金资助项目，编号: H2015074; 4.佳木斯大学科技重点项目，编号: Sz2011－009。

中图分类号:R285.5; R73－36

文献标识码:A

文章编号:1008－0104(2016) 02－0133－01