RT－PCR检测SALL4基因骨髓增生异常综合征的表达①

武广海，田黎明，于广晴，张　纯，袁嘉怡，申福国

(1.佳木斯大学附属第一医院，黑龙江佳木斯154003;2鹤岗市人民医院急救中心，黑龙江鹤岗154100)



RT－PCR检测SALL4基因骨髓增生异常综合征的表达①

武广海1，2，田黎明1，于广晴1，张纯1，袁嘉怡1，申福国1

(1.佳木斯大学附属第一医院，黑龙江佳木斯154003;2鹤岗市人民医院急救中心，黑龙江鹤岗154100)

摘要:目的:探讨骨髓增生异常综合征(MDS)患者骨髓中SALL4mRNA表达及其临床意义。方法:通过RT－PCR方法分别检测13例难治性贫血患者(MDS－RA)、27例难治性贫血伴原始细胞增多患者(MDS－RAEB)和11例正常对照组骨髓单个核细胞(BMMNC)中SALL4mRNA表达情况，并比较MDS－RA和MDS－RAEB之间的表达差异。结果: MDS患者骨髓中SALL4 mRNA表达均明显高于正常对照，且MDS－RAEB表达量高于MDS－RA，差异有统计学意义(P＜0.01)。结论: SALL4mRNA基因可能参与了MDS的发病，MDS－RA和MDS－RAEB之间的SALL4基因表达差异可能提示2者的发病机制的不同。

关键词:SALL4mRNA;骨髓增生异常综合征; RT－PCR

骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome，MDS)是一组髓系具有异质性呈病态克隆性疾病［1］，其基本病变主要是造血干克隆性增生、祖细胞异常发育，往往累计数个造血系统(例如粒系、红系和巨核系等)为主要特点的血液系统疾病; MDS临床特征主要表现为造血异常、血细胞的质与量出现异常，并有向急性白血病高危转化的可能［2，3］。MDS目前扔没有统一有效的治疗方案，其临床治疗预后差，其疾病的病因和发病机制目前尚不明了。依据2008年最新WHO的分型修订版中将MDS划分为七型［4］:①难治性血细胞减少伴单系病态造血(RCUD )，②难治性贫血伴环状铁粒幼细胞(RARS )，③难治性血细胞减少伴多系病态造血(RCMD)，④难治性贫血伴原始细胞增多－1(RAEB －1)，⑤难治性贫血伴原始细胞增多－2(RAEB－2)，⑥MDS－未分类(MDS－U )，⑦MDS伴单纯5q－。而在实际的临床工作中既往FAB协作组分型仍在使用，其MDS－RA和RAEB类型在临床诊断和治疗中更易见。

婆罗双树样基因4(SALL4)是最近研究发现的一种新的致癌基因，SALL4是婆罗双树样基因家族的最新成员，最早是在果蝇体内发现的婆罗双树样基因之一，SALL4是具有多个C2H2结构的序列的一种蛋白转录因子［5］。有研究表明SALL4在生殖细胞肿瘤、肝样胃癌等肿瘤疾病的发生、发展和转归有重要意义［6，7］。而到目前为止，国内外对对MDS患者体内SALL4基因及其蛋白表达的研究报道较少。本研究主要采用PCR方法对临床较为常见MDS－RA和RAEB类型的MDS患者的外周SALL4 mRNA的表达情况进行了检测，以初步探讨MDSRA和RAEB类型的MDS患者SALL4mRNA表达水平及其临床意义。

1　资料和方法

1.1一般资料

选择2012－12～2014～09在我院血液科就诊的40例骨髓增生异常综合征(MDS)患者其中男21例，女19例，年龄36～74岁，平均54.3岁。其中收集难治性贫血(MDS－RA)患者13例，难治性贫血伴原始细胞增多(MDS－RAEB)患者27例，所有患者诊断依据张之南主编的《血液病学》的MDS诊断标准确诊［1］。随机选取健康体检人11例作为对照组，其中男7例，女4例，年龄30～57岁。

1.2主要材料及试剂

PCR扩增仪(美国BIO－BAD公司) ;稳压稳流电泳槽(北京六一实验仪器厂) ;超净工作台(苏州净化厂) ; 0.02% EDTA(Sigma，美国) ; MarkerDL50(武汉博士德) ; cDNA第一链合成试剂盒、RT－PCR扩增试剂盒(天津市灏洋生物)。

1.3骨髓样本的处理

在无菌条件下取患者和健康查体的3mL新鲜骨髓液加入含肝素的抗凝管中，首先滴加适量PBS液稀释，再次加入Ficoll淋巴细胞分离液(体积比1: 1混合)，混合均匀后离心(1500rpm)，离心20min，弃上清液后，留取中间白膜层的单个核细胞，取中间层液体再次加入PBS缓冲液冲洗，混合均匀后离心(2000rpm0，离心10min，留中间层后加入PBS缓冲液冲洗后放置于－80℃冰箱保存备用。

1.4 RNA的提取和cDNA合成

取上述标本，加入500μL的Trizol反复震荡摇匀、静置5min后加入0.2mL氯仿、1200rpm低温离心15min，取上清液加入等体积异丙醇混合均匀，30min后再次低温离心，弃上清加入75%乙醇震荡后再次低温7500rpm离心10min，弃上清部分检测RNA浓度，其余RNA置于－40℃保存备用。

取上述获得RNA标本产物，参阅文献［8］中相关经验，严格按照cDNA合成试剂盒说明书进行逆转录，获得的cDNA产物置于－40℃冰箱保存备用。

1.5 PCR反应

(1)反应体系取25uL反应液其包括:逆转录产物(cDNA) 2μL，上游引物和下游引物各1μL、Magic-Mix液12.5μL;其余用蒸馏水配置至25μL。(2) SALL4基因的扩增反应条件为:开始95℃变性4min，其次95℃变性30s，再次61℃退火30s，紧接着72℃延伸1min，方法同上进行35个循环后72℃延伸5min，反应结束。(3)β－actin的扩增条件同SALL4基因过程。

表1　引物详情

1.6统计学方法

采用SPSS17.0统计软件处理，统计描述用均数±标准差(±s)表示，不同组别间采用单纯性方差分析，(P＜0.05)表示有统计学意义。

2　结果

SALL4 mRNA在MDS－RAEB、MDS－RA、正常对照组的表达及其ODR值SALL4 mRNA RT－PCR产物大小为282bp，内参β－actin为127bp，其基因表达产物泳带见图1。SALL4基因在正常对照组无表达未见电泳条带;在MDS－RAEB和MDS－RA组中可见表达，其电泳条带清晰，但是MDS－RAEB组表达较MDS－RA组高。见图1。

通过其quelity one灰度分析软件对所有条带进行灰度分析SALL4基因与β－actin基因扩增产物电泳带的灰度比值(ODR)发现，正常对照组SALL4mRNA相对ODR值与MDS－RAEB组、MDS －RA组比较，差异有统计学意义(P＜0.05) ; MDS －RAEB组较MDS－RA组相比较明显较高(P＜0.05)，差异有统计学意义。见图2。

图1　各组患者RT－PCR电泳

图2　实验组中SALL4 /β－actin比值(ODR值) 注:*表示P＜0.05

3　讨论

MDS在各年龄段人群均可发病，其中以老年居多，其每年发病率约为15/10万～50/10万，但是随着医疗科学的发展和社会老龄化加其每年的发病率具有上升的趋势［2］。由于目前对MDS的发病机制及其向急性白血病转化的机制还不十分明确，导致目前对该病的诊断难度大，治疗效果差。

SALL4是最新研究发现婆罗双树样基因(SALL)家族中的致癌基因之一，该基因是果蝇Spalt的同源异型基因;有研究表明SALL4基因中含有4个外显子，它们分别编码后可产生两种蛋白即SALL4A蛋白和SALL4B蛋白，该蛋白物质也具有婆罗双树样基因家族成员结构相似［5］。有研究发现LEF1和TCF4F能有效激活SALL4转录，从而激活经典的Wnt信号转导通路，e－myc细胞周期蛋白D1(CyclinD1)基质金属蛋白酶7(MMP－7)为Wnt信号的靶基因在肿瘤发生发展过程中起重要的作用，提示SALL4基因具有导致肿瘤发生的潜能同时SALL4具有维持干细胞特性的作用和致瘤的潜能［9］。

有研究发现在很多生殖系统［10］(如卵黄囊瘤、无性细胞瘤、精原细胞瘤等肿瘤)中均发现SALL4异常表达;马从乾［11］等人研究发现绝大多数的肝癌组织中SALL4的蛋白呈现高表达; SALL4的表达量与患者性别、年龄、肿瘤大小等因素无相关性。有学者通过SALL4转基因小鼠模型研究发现［12］，在过度表达的动物出生14～24d可见骨髓异常增生活跃现象同时也可见造血细胞过度凋亡现象，还在动物外周血中发现红系和粒系数量的减低;在实验动物出生后6～8个月时可见很多未成熟的原始细胞、血小板、有核红细胞等表现，这些均为典型的MDS样病态造血相，此时还可见约有半数的实验动物最终转化为了急性白血病。然而又有学者在白血病中研究SALL4基因证实，SALL4蛋白可以通过与组蛋白脱乙酰酶(HDAC)进行复杂的一些列的反应过程后可抑制PTEN，进而促进白血病的进一步发展;在实验中他们加入一种活性肽来拮抗抑制SALL4蛋白与组蛋白脱乙酰酶的反应，可以有效的解除对PTEN抑制，促进了具有SALL4蛋白高表达的恶性肿瘤细胞凋亡［13］。

本实验主要是通过RT－PCR方法测定MDS患者骨髓的单个核细胞标本中SALL4 mRNA含量，本实验研究发现正常对照组样本中PCR结果未见电泳条带，这也说明正常对照组的骨髓单个核细胞中SALL4 mRNA基本未见表达，而在在MDS－RAEB 和MDS－RA组中可见表达，其电泳条带清晰可见，但是MDS－RAEB组中SALL4 mRNA含量灰度值较MDS－RA组高，这也说明在MDS组实验样本的骨髓单个核细胞中ALL4 mRNA呈现高表达水平，这与对照组比较有明显的统计学差异(P＜0.05)，这正与段梦夕［14］和丁柳美等［15］人的研究结果基本一致。丁柳美等人研究发现MDS患者的外周血和骨髓中SALL4mRNA表达均明显高于对照，且骨髓标本较外周血标本表达强;他们还在MDS各亚型中研究发现，各亚型之间有统计学差异，且在RAEB－Ⅰ及RAEB－Ⅱ这两个亚型标本中具有较强的表达。然而本实验则是把MDS中的RA与RAEB两种临床中最常见的亚型进行比较，本实验研究发现MDS－RA组患者骨髓样本中SALL4 mRNA含量表达水平明显高于正常对照组患者骨髓样本中表达量，MDS－RAEB组患者骨髓样本中SALL4 mRNA含量表达水平高于MDS－RA组，差异有统计学意义(P＜0.05)。上述实验研究结果提示了SALL4基因在正常对照组和MDS中RAEB－Ⅰ和、RAEB－Ⅱ这两个亚型之间表达存在明显差异，这对于临床上MDS的诊断和分型提供了实验依据，SALL4基因的检测将来可能作为判断骨髓增生异常综合征患者发病及其协助分型的指标之一。

目前对于SALL4基因功能和引起MDS发生机制的研究目前仍然处于初级阶段，虽然有文献研究表明，SALL4基因在MDS患者身上可以检测到该基因的表达有一定的相关性。本实验深入地探讨SALL4基因在MDS常见亚型中表达情况，对于探讨MDS的具体发病机制及今后更准确地诊断和靶向治疗恶性血液病提供潜在的新途径。本实验研究虽然发现SALL4基因在对照组无表达，MDS－RAEB组和MDS－RA高表达，且前者高于后者;但是本次实验由于收集测定的标本较少、其他分型也未检测，未连续进行病例跟踪检测，因此我们需要进一步扩大实验样本填补实验样本的偏少带来的不足。

参考文献:

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Detection of SALL4 mRNA expression in myelodysplastic syndrome by RT－PCR

WU Guang－hai1，2，TIAN Li－ming1，YU Guang－qing1，ZHANG Chun1，YUAN Jia－yi1，SHEN Fu－guo1
(1.The First Affiliated Hospital of Jiamusi University，Jiamusi 154003，China; 2.The Eemergency Center of Hegang People’s Hospital，Hegang 154100，China)

Abstract:Objective: To investigate the expression of SALL4 mRNA and its clinical significance on myelodysplastic syndrome (MDS) patients with bone marrow SALL4 mRNA Expression and clinical significance.Methods: RT－PCR，13 cases were detected in patients with refractory anemia (MDS－RA).，27 patients with refractory anemia with excess blasts in patients (MDS－RAEB) and 11 cases of normal bone marrow mononuclear cells (BMMNC ) in SALL4mRNA expression and compared expression differences between MDS－RA and MDSRAEB betwee.Results: SALL4 mRNA expression in MDS patients were significantly higher than that in the control group.，aAnd MDS－RAEB higher expression of MDS－RA，the difference was statistically significant (P＜0.01).Conclusion: SALL4mRNA gene may be involved in the pathogenesis of MDS，SALL4 gene expression between differences MDS－RA and MDS－RAEB may suggest different pathogenesis.between two persons may suggest different pathogenesis.

Key words:SALL4mRNA; myelodysplastic syndrome; RT－PCR

(收稿日期:2015－03-04)

通讯作者:田黎明(1962～)男，黑龙江佳木斯人，硕士，主任医师，硕士研究生导师。E－mail: TLM3388@163.com。

作者简介:①武广海(1975～)男，黑龙江鹤岗人，在读硕士研究生。

中图分类号:R551.3

文献标识码:A

文章编号:1008－0104(2016) 02－0096－03