甘草次酸对人胃癌HGC－27的抑制增殖和诱导凋亡作用①

贾洪岩，林　芳，王立敏，刘　丹

(1.沈阳药科大学基于靶点的药物设计与研究教育部重点实验室，辽宁沈阳110000;2.佳木斯大学基础医学院，黑龙江佳木斯154007)



甘草次酸对人胃癌HGC－27的抑制增殖和诱导凋亡作用①

贾洪岩1，2，林芳1，王立敏2，刘丹1

(1.沈阳药科大学基于靶点的药物设计与研究教育部重点实验室，辽宁沈阳110000;2.佳木斯大学基础医学院，黑龙江佳木斯154007)

摘要:目的:研究18β－甘草次酸(glycyrrhetinic acid，GA)对人胃癌细胞HGC－27生长抑制作用及对细胞凋亡的影响。方法:分别以12.5、25、50、100和200 μM的GA处理HGC－27细胞，MTT法检测不同时间点(24、48和72h)的细胞增殖抑制率，以AO/EB法初步观察GA诱导HGC－27凋亡的情况，以Annexin V－FITC/PI双染色法检测细胞凋亡率确定凋亡的发生。结果: GA能抑制HGC－27细胞生长，且呈剂量依赖性，GA可以引起HGC－27细胞核皱缩、染色质浓缩、细胞膜发泡、等凋亡特征，提示了凋亡的参与，通过Annexin V/PI双染色法最终确定GA可剂量依赖性地引起HGC－27的凋亡。结论: GA可抑制人胃癌细胞HGC－27增殖，其作用机制可能与GA引起HGC－27凋亡有关。

关键词:甘草次酸; HGC－27细胞;细胞凋亡

胃癌是一种严重威胁人类健康的疾病，在许多恶性肿瘤当中，其发病率高居第二位。在临床上，利用Ki－67、RAB5A、VHL、Survivin以及HGF等的表达情况来诊断早期胃癌的发生［1～3］。多数早期胃癌的治疗均采取局部切除的方法，而对于晚期胃癌，手术切除后仍有复发或转移的可能，其术后5年生存率始终保持在30%左右。近几年的研究表明，中药不管是在肿瘤的早期或者中期作为手术、化疗以及介入治疗的一种辅助手段，还是在肿瘤的晚期由于患者失去了最佳手术机会且对化疗的耐受力下降或者进行介入治疗时其作为一种必要的治疗手段均在临床上表现出了优越的效果［4，5］。18β－甘草次酸是中草药甘草的一种重要有效成分。现代药理学研究表明，甘草次酸具有调节免疫系统、抗肝毒素、抗肿瘤、抗溃疡、抗病毒以及抗炎等多种生理活性［6～9］。GA对一些肿瘤细胞生长具有一定的抑制作用［10，11］，有关甘草次酸对胃癌细胞HGC－27生长作用的报道较少，对其抗肿瘤的确切机制亦不清楚，本研究观察甘草次酸对胃癌细胞系HGC－27细胞生长的抑制作用，探讨其可能的作用机制，为胃癌的临床治疗提供实验依据。

1　材料与方法

1.1材料

药品与主要仪器: GA:购于Sigma公司; CO2培养箱:德国贺利氏公司;酶标仪:美国Bio－Rad公司;荧光显微镜:德国Leica公司;流式细胞仪:美国Becton Dickson公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养

HGC－27细胞培养于含10 %胎牛血清100μg/mL青霉素、100μg/mL链霉素、0.2% NaHCO3的RPMI－1640培养液中的中，置于37℃、5 % CO2的培养箱中培养，0.25 %的胰酶消化传代。

1.2.2显微镜下细胞形态的观察

取对数生长期的细胞进行消化传代，并且在培养24h后加入甘草次酸终浓度为25、50、100μM的培养液连续培养24h后置于倒置显微镜下观察细胞生长情况。

1.2.3 MTT法

细胞生长至培养皿的80%时弃去培养液，在消化和离心后收集细胞，加入新鲜的培养液，慢慢吹打培养液使其成单细胞悬液;之后将单细胞悬液稀释至细胞数为2×105个/mL，吹均匀后，将96孔板中的每孔加入100μL的单细胞悬液，然后放于培养箱中，24h后加药处理，每个浓度设置四个复孔，与细胞共同孵育24h、48h和72h后，每孔分别加入50μL 2mg/mL的MTT溶液，于培养箱中继续孵育4h;甩板后倒扣于滤纸上，在滤纸充分吸干残留的液体后，每孔分别加入200μL的DMSO，然后放于振荡器上振荡10min以使得蓝色结晶物溶解;用酶标仪在570nm处测其吸光度值，设200μL DMSO为空白对照。

由以下公式计算细胞生长的抑制率:

抑制率(%) = 1－(对照细胞OD值－加药细胞OD值) /对照细胞OD值×100%

将药物浓度的对数值与细胞的存活率作线性回归，可求出药物对肿瘤细胞的半数生长抑制浓度及IC50值。

1.2.4 AO/EB双染荧光试验

取处于对数生长期的HGC－27细胞，以每孔的细胞密度为2×105个/mL接种于24孔板中，每孔800μL。然后分别用浓度为25、50、100μM的药物处理后，收集细胞，离心，弃去上清液，重悬于100μL 的PBS中，然后加入AO/EB等体积混合液16μL (100 μg/mL AO，100μg/mL EB)，混匀后，吸一滴混合液于洁净的载玻片上，用盖玻片封片，放于荧光显微镜下观察并拍照。EB拒染并出现细胞膜发芽、发泡、核皱缩以及凋亡小体的细胞则被认为是凋亡细胞。

1.2.5 Annexin V－FITC/PI双染色法检测细胞凋亡

在36 h时收集各组的HGC－27细胞，用PBS洗涤2次，按Annexin V－FITC /PI试剂盒的说明书操作。在1h内利用流式细胞仪检测细胞的凋亡率，采用Cell Quest V 3.2软件来获取和分析数据。

2　结果

2.1细胞形态学观察

倒置显微镜下观察对照组细胞生长旺盛，形态成梭形或者多边形，贴壁生长牢固，折光率较高，细胞膜生长完整。甘草次酸处理过的HCG－27细胞随着浓度的增加增殖变慢且细胞逐渐变小变圆，折光变差等，部分细胞漂浮在培养瓶中。甘草次酸浓度越高，上述表现越明显。见图1。

A.对照; B.甘草次酸25μM; C.甘草次酸50μM; D.甘草次酸100μM图1　不同浓度GA作用24 h后显微镜观察细胞变化

A.对照; B.甘草次酸25 μM; C.甘草次酸50 μM; D.甘草次酸100 μM图2　AO/EB检测不同浓度GA作用48 h后HGC－27形态变化

2.2 GA对HGC－27细胞生长抑制情况

分别以12.5、25、50、100和200μM的GA处理HGC－27细胞，MTT法检测不同时间点(24、48和72h)的细胞增殖抑制率，GA随着作用时间的增加对HGC－27有一定的生长抑制作用，并且随着时间的延长具有时间依赖性，见表1。

表1　药物处理不同时间GA对HGC－27的IC50

2.3 GA对HGC－27的AO/EB染色结果

通过对先前细胞的形态学变化和GA对HGC－27的抑制作用，提示GA对HGC－27可能具有促进凋亡的作用，而细胞凋亡时，形态学的变化是重要的特征之一。图2是不同浓度的GA作用在HGC－27细胞48h后荧光染色的结果。对照组细胞的细胞核形状规则，染色均一。而GA处理组随着浓度的升高出现了细胞核皱缩、染色质浓缩、细胞膜发泡、边缘化等明显的凋亡形态学改变。

2.4细胞凋亡改变

Annexin V－FITC/PI双染色后流式细胞仪检测结果显示，对照组及25、50、100 μM的GA作用36h后早期凋亡率分为别0.72%、1.06 %、9.5%、17.58%。与对照组相比证明GA可以诱导HGC－27早期凋亡，见图3。

A对照组B 25 μM组C 50 μM组D 100 μM组图3　不同浓度GA作用36 h后HGC－27细胞流式凋亡分析

3　讨论

通过光学显微镜我们初步观察到GA可以抑制胃癌细胞HGC－27生长，MTT法检测GA对HGC－27细胞72h的IC50为59.32μM，根据细胞形态，凭经验推测可能有凋亡发生，继续采用AO/EB法初步提示凋亡确实存在。进而，Annexin V－FITC/PI法用来检测细胞早期凋亡时膜上的磷脂酰丝氨酸(PS)外翻，该指标一直作为细胞凋亡判断的金指标，我们的实验结果证实了GA确实诱导了凋亡，且呈剂量依赖性。与文献报道GA具有多种抗肿瘤活性相一致，GA具抗恶性胃癌细胞的作用，我们认为在治疗和预防早期胃癌可能有应有前景。有报道称，如果可以联合用药的几种药物之间存在协同效应，那么其不仅可以减轻药物副作用，同时可以增强药物的疗效［6］。甘草次酸属于较温和的天然产物，安全性高，高振北等［12］报道，全反式维甲酸与甘草次酸联合应用，则可以协同抑制PGCL3细胞(人肺癌细胞)的侵袭和转移。本文发现甘草次酸单独应用有一定抗胃癌效果，这为开发其和相关药物联用研究提供了一定的参考价值。但其具体作用机制还有待进一步研究。开发甘草次酸与其他药物合用治疗胃癌，可能更具有临床价值。

参考文献:

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［11］Csuk R，Schwarz S，Kluge R，et al.Synthesis and biological activity of some antitumor active derivatives from glycyrrhetinic acid［J］.Eur J Med Chem，2010，45(12) : 5718

［12］高振北，康潇，许传莲.甘草次酸抗肿瘤作用机制的研究进展［J］.中国中药杂志，2011，36(22) : 3213－3216

(收稿日期:2015－05－24)

通讯作者:王立敏(1973～)女，黑龙江佳木斯人，博士，教授，硕士研究生导师。E－mail: wlmtong@163.com。

作者简介:①贾洪岩(1990～)女，黑龙江绥化人，在读硕士研究生。

中图分类号:R735.2

文献标识码:A

文章编号:1008－0104(2016) 02－0088－03