CaMKⅡ在高脂血症大鼠阴茎海绵体中的表达及其对RAF/MEK含量的影响①

孙盛洋，郭玉刚

(佳木斯大学附属第一医院泌尿外科，黑龙江佳木斯154003)



CaMKⅡ在高脂血症大鼠阴茎海绵体中的表达及其对RAF/MEK含量的影响①

孙盛洋，郭玉刚

(佳木斯大学附属第一医院泌尿外科，黑龙江佳木斯154003)

摘要:目的:研究高脂血症对大鼠阴茎海绵体中钙调素依赖性蛋白激酶(calcium/calmodulin－dependent protein kinaseⅡ，CaMKⅡ)表达的影响和对RAF激酶/分裂原活化抑制剂(RAF/MEK)含量的影响。方法:32只雄性Wistar大鼠随机分为实验组和对照组，在实验第10天和第20天，随机各选两中组一半大鼠观察勃起情况;采用免疫组化及图像分析的实验方法对其海绵体所含CaMKⅡ研究观察并测所含计量，同时测量P－RAF的表达情况;以分光光度的实验方法对海绵体匀浆中一氧化氮合酶(NOS)的活性浓度进行量的测量。结果:实验第10天，实验组CaMKⅡ表达较对照组低，NOS活性及大鼠阴茎勃起次数均降低(P＜0.05) ;实验第20天，实验组及对照组的CaMKⅡ均降低，P－RAF的表达呈减少趋势(P＜0.05)，与第10天相比明显降低(P＜0.05)。结论:高脂血症大鼠阴茎海绵体CaMKⅡ、P－RAF表达下降，NOS活性降低，高脂血症是勃起功能障碍诱因。

关键词:高脂血症; CaMKⅡ; P－RAF;一氧化氮合酶

男性疾病中勃起障碍(ED)较为常见，越来越多的学者研究此疾病的流行及其发病原理。许多实验资料及临床记录表明高脂血症引起阴茎勃起障碍，主要是由晚期动脉堵塞所致对内皮细胞与平滑肌的作用及对阴茎外周神经的控制受到破坏。目前研究表明，细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK1/2)通过磷酸化而对内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)活性进行抑制从而使海绵体中平滑肌兴奋性降低最终致阴茎勃起障碍，但目前尚未找到其磷酸化的作用点［1］。ERK1/2信号与有关信号共同在在大鼠海绵体平滑肌细胞及内皮细胞内作用调节阴茎勃起。本实验研究对Raf/MEK/ERK1/2信号通路于大鼠阴茎的勃起中起到的作用及其各信号之间的联系做了记录，以求探清对阴茎勃起的作用分子［2］。

1　材料和方法

1.1实验动物

实验动物挑选种系相同，年龄皆为3个月的雄性大鼠Wistar共计32只，随机分配分为两组，一组为实验组(高脂血症大鼠)，一组为对照组(正常大鼠)，各为16只。

1.2试验方法

通过培养实验模型进行血液检查、病理检查。对阴茎勃起的功能进行测定，收集标本和制备阴茎海绵体匀浆，制作切片后观察组织形态，用染色法观察阴茎组织中的CaMKⅡ，并计算灰度值。采用考马斯亮兰法检测组织蛋白的浓度，根据NOS试剂盒的说明书进行准确操作测定NOS的活性。

1.3统计学方法

试验数据两两比较用t校验，多组比较运用方差分析，直线相关回归处理相关统计，以均数±标准差来表示实验的各项数据，当P＜0.05有统计学意义。

2　结果

2.1阿朴吗啡临床效果

颈部给予注射APO后，观察大鼠阴茎勃起功能表现，高脂组10d阴茎勃起次数(2.05±0.68)与对照组10d (3.18±1.34 )相比，显著减少(P＜0.05) ;高脂组20d(1.14±0.29)阴茎勃起次数与对照组20d (3.21±1.30)相比，显著减少(P＜0.05) ;高脂组20d(1.14±0.29)与高脂组10d(2.05±0.68)相比，阴茎勃起次数明显降低(P＜0.05)。

2.2 eNOS和NOS蛋白表达

在阴茎海绵体与窦壮隙内皮细胞的细胞核和细胞浆中，主要表达eNOS蛋白，黄棕色颗粒表示其为阳性，呈局部性、散在性分布。而在阴茎海绵体平滑肌组织细胞及其间质中，主要表达eNOS蛋白，棕褐色为阳性表达标准，表现为弥漫性。各组的eNOS阳性反应，见表1。

1eNOS(±s)

1eNOS(±s)

注:*与对照组比较P＜0.05;△与高脂组10d比较P＜0.05。

组别　eNOS蛋白吸光度值A实验组10d观察组　0.0816±0.0028*20d观察组　0.0651±0.0062＊△对照组10d观察组　0.1143±0.0013 20d观察组0.1063±0.0024

2.3大鼠阴茎组织内CaMKⅡ的检测CaMKⅡ免疫

组织化学染色

CaMKⅡ阳性着色均呈棕黄色颗粒，主要定位于海绵窦和血管内皮细胞。图像分析结果:高脂组与对照组相比，大鼠阴茎海绵体组织细胞胞浆内CaMKⅡ的平均灰度值明显升高(P＜0.05) ;高脂组两个阶段相比，高脂组20d与高脂组10d比较，大鼠阴茎海绵体组织内CaMKⅡ的平均灰度值有显著性差异(P＜0.05)，说明随病程延长，CaMKⅡ的表达逐渐增加。

表2　高脂血症组和对照组大鼠阴茎组织中CaMKⅡ的平均灰度值(±s)

表2　高脂血症组和对照组大鼠阴茎组织中CaMKⅡ的平均灰度值(±s)

注:#与对照组比较P＜0.05;▲与高脂组10d比较P＜0.05。

组别　　平均灰度值对照组10d　102.35±3.17对照组　20d　103.10±2.85高脂组　10d　121.28±3.76#高脂组　20d　140.56±3.95▲

2.4 P－RAF的测定

高脂组大鼠阴茎海绵体组织中P－RAF含量较对照组明显增加(P＜0.05) ;高脂组20d大鼠阴茎海绵体组织中P－RAF含量较高脂组10d增加(P＜0.05)，说明随病程延长，P－RAF含量逐渐增加。

表3　高脂血症组和对照组大鼠阴茎组织中P－RAF含量(±s)

表3　高脂血症组和对照组大鼠阴茎组织中P－RAF含量(±s)

注:⊿与对照组比较P＜0.05;▲与高脂组10d比较P＜0.05。

组别　P－RAF 浓度对照组10d　5.84±0.41对照组　20d　3.55±0.37高脂组　10d　7.08±1.27⊿高脂组　20d　7.42±1.28▲

3　讨论

本次研究通过建立患有高脂血症大鼠的动物模型，推测高脂血症对于大鼠阴茎内的eNOS的作用效果，研究疾病发生的病理机制。实验结果显示，两组的阴茎勃起频率明显降低，eNOS的活性也受到明显抑制，实验组与对照组存在明显差异，证明高脂血症对大鼠阴茎内的eNOS的活性具有抑制作用，继而造成阴茎勃起功能障碍。此外，实验组对于六周后与12周后的实验数据进行比较分析，发现eNOS的活性均受到明显抑制，推测此结论为阴茎勃起功能障碍的病理机制［3］。CaMKⅡ免疫组织化学染色结果: CaMKⅡ阳性着色均呈棕黄色颗粒，主要定位于海绵窦和血管内皮细胞［4］。图像分析结果:高脂组与对照组相比，大鼠阴茎海绵体组织细胞胞浆内CaMKⅡ的平均灰度值明显升高(P＜0.05) ;高脂组两个阶段相比，高脂组20d与高脂组10d比较，大鼠阴茎海绵体组织内CaMKⅡ的平均灰度值有显著性差异(P＜0.05)，说明随病程延长，CaMKⅡ的表达逐渐增加。高脂组大鼠阴茎海绵体组织中PRAF含量较对照组明显增加(P＜0.05) ;高脂组20d大鼠阴茎海绵体组织中P－RAF含量较高脂组10d增加(P＜0.05)，说明随病程延长，P－RAF含量逐渐增加。CaMKⅡ表达增加，P－RAF含量增加，影响eNOS在大鼠阴茎海绵体中的含量，这可能是高脂血症引起ED的发病机制之一［5］。根据上述报告显示，通过喂养法建立动物模型并进行观察研究，结果表明阴茎勃起与高脂血症具有密切关系［6］。由于国人在饮食以及生活环境受到很多负面影响，促使高脂血症及其并发症的发病率逐年升高［7］。本次试验的研究结果证实高脂血症对于阴茎勃起功能的影响，高脂血症大鼠阴茎海绵体CaMKⅡ、P－RAF表达下降，NOS活性降低。高脂血症是勃起功能障碍的诱发因素的一种。

参考文献:

［1］Lue TF，Physiology of erection and pathophysiology of impotence.In Walsh PC，et al.eds Campbell’s Urology.6thed［M］.Saunders，1992: 709－728

［2］Bredt DS.Endogenous nitric oxide synthesis : biological functions and pathophysiology［J］.Free Radic Res，1999，31(6) : 577－596

［3］郝鹏，李坚，罗振国，等.高同型半胱氨酸血症大鼠与勃起功能障碍的相关性研究［J］.黑龙江医药科学，2013，36(1) : 97－98

［4］张天宇，杜从林，迟宝进，等.增龄对大鼠阴茎海绵体内CSE及H2S含量变化的影响［J］.黑龙江医药科学，2015，38(4) : 137－140

［5］郝鹏，马飞虹，罗振国，等.高半胱氨酸血症大鼠阴茎海绵体内Hcy及MTHFR的相关性研究［J］.黑龙江医药科学，2014，37 (1) : 38－42

［6］孙文娟，刘洁，杨世杰，等.不同产地长梗燕白提取物对高脂血症大鼠脂代谢的影响及其抗氧化作用［J］.白求恩医科大学学报，1999，25(3) : 259－261

［7］李三祥，戴玉田.阴茎血管活性物质及其功能递质在勃起功能障碍发病中的作用［J］.中华男科学杂志，2005，11(11) : 843－846

The expression of hyperlipidemia CaMKⅡin rat corpus cavernosum and its impact on RAF/MEK content

SUN Sheng－yang，GUO Yu－gang
(The First Affiliated Hospital of Jiamusi University，Jiamusi 154003，China)

Abstract:Objective: To study the effects of CaMKⅡin rat corpus expression and influence of hyperlipidemia on the RAF / MEK＇s.Methods: 32 male wistar rats were randomly divided into experimental and control groups in the experiment 10 days and 20 days.Rats were randomly selected in each group，and they were observed erections half; measuring the expression of CaMKⅡ，P－RAF＇s; nitric oxide synthase (NOS) activity concentrations.Results: In the first 10 days，the experimental group CaMKⅡexpression compared with the control group，NOS activity and penile erections were lower (P＜0.05) ; experiment first 20 days，the experimental group and the control group CaMKⅡdecreased，P－RAF expression tended to decrease (P＜0.05)，which was significantly lower compared with the first 10 days (P＜0.05).Conclusion: The expression of corpus cavernosum CaMKⅡ，P－RAF for hyperlipidemia rat decreased，and NOS activity is low.Hyperlipidemia is the incentive of erectile dysfunction.

Key words:hyperlipidemia; CaMK ; P－RAF; nirtic oxide synthase

(收稿日期:2015－12－07)

通讯作者:郭玉刚(1967～)男，黑龙江佳木斯人，硕士，教授，硕士研究生导师。E－mail: 15145487111@163.com。

作者简介:①孙盛洋(1982～)男，黑龙江富锦人，硕士，住院医师。

中图分类号:R691.5

文献标识码:A

文章编号:1008－0104(2016) 02－0061－02