MMP-3 mRNA在左、右半结肠癌组织中的表达及其与患者临床病理参数和预后的关系

许开宇，连正杰，伍江平，高宏，丁磊

(首都医科大学附属北京世纪坛医院，北京100038)

·论著·

MMP-3 mRNA在左、右半结肠癌组织中的表达及其与患者临床病理参数和预后的关系

许开宇，连正杰，伍江平，高宏，丁磊

(首都医科大学附属北京世纪坛医院，北京100038)

目的 探讨基质金属蛋白酶3(MMP-3)mRNA在左半结肠癌(LSCC)、右半结肠癌(RSCC)组织中的表达及其与患者临床病理参数和预后的关系。方法 选择结肠腺癌患者80例，以结肠脾曲为界分为LSCC、RSCC各40例。取手术切除的癌组织及其配对的癌旁正常结肠组织，采用Real-time qRT-PCR法检测不同结肠组织中MMP-3 mRNA表达，并分析其表达与患者临床病理参数及预后的关系。结果 LSCC及RSCC组织中MMP-3 mRNA表达均高于其配对的癌旁正常结肠组织，且LSCC组织中MMP-3 mRNA表达明显高于RSCC组织(P<0.01)。无论LSCC还是RSCC，MMP-3 mRNA高表达均与患者脉管癌栓、异时性远处脏器转移有关(P均<0.05)；MMP-3 mRNA高表达与LSCC患者肿瘤浸润深度及癌症相关死亡有关(P均<0.05)。Kaplan Meier生存分析显示，MMP-3 mRNA高表达者中位生存时间明显低于低表达者(P<0.01)；分层分析发现，LSCC患者MMP-3 mRNA高表达者中位生存时间明显低于低表达者(P<0.05)，MMP-3 mRNA表达对RSCC患者预后无明显影响(P>0.05)。结论 LSCC组织中MMP-3 mRNA表达明显高于RSCC组织；MMP-3 mRNA高表达仅是LSCC患者的不良预后因子。

左半结肠癌；右半结肠癌；基质金属蛋白酶3；临床病理参数；预后

结直肠癌(CRC)是消化系统常见的恶性肿瘤，是具有复杂异质性的疾病。Distler等[1]研究发现，左半结肠癌(LSCC)和右半结肠癌(RSCC)的临床特征存在差异。近年来随着研究的深入，发现CRC并不遵循统一的致癌模式，其内部至少存在三条致癌途径，即染色体不稳定(CIN)途径、微卫星不稳定(MSI)途径和锯齿途径(CPG岛甲基化表型阳性)[2]。CIN途径主要累及左半结肠，MSI途径、锯齿途径主要累及右半结肠。由于LSCC和RSCC的致癌机制不同，推测其内部存在许多差异表达的基因。基质金属蛋白酶3(MMP-3)是MMP家族中的间充质溶解素之一，可直接降解肿瘤细胞外基质成分；有研究发现，MMP-3可与尿纤溶酶原激活物(uPA)共表达，uPA能激活纤溶酶原成纤溶酶，纤溶酶再激活proMMP-3产生活性MMP-3，MMP-3再作用于proMMP-9产生活性MMP-9，继而促进肿瘤进展[3，4]。目前从结肠癌内部异质性出发研究LSCC和RSCC组织中MMP-3表达的报道较少。本研究观察MMP-3在LSCC、RSCC组织中的表达差异，并分析其表达与患者临床病理参数及预后的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2008～2010年在我院手术的结肠腺癌患者80例。纳入标准：①散发性结肠癌；②术前未进行放化疗；③接受结肠癌根治性手术，术后组织病理检查确认为腺癌；④有完整的临床资料。其中，男40例、女40例，年龄(58.1±11.1)岁；肿瘤部位：盲肠癌7例，升结肠癌14例，结肠肝曲癌14例，横结肠癌5例，结肠脾曲癌3例，降结肠癌6例，乙状结肠癌29例，直肠乙状结肠交界处癌2例；大体形态：隆起型23例，溃疡型57例；组织学类型：腺癌67例，黏液腺癌13例；组织分化程度：高分化10例，中分化48例，低未分化22例；肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)：阳性15例，阴性65例；肿瘤浸润深度：T356例，T424例；有淋巴结转移40例，无淋巴结转移40例；发生异时性远处转移17例，未发生异时性远处转移63例。以结肠脾曲为界，分为RSCC组40例、LSCC组40例，两组性别、年龄等临床病理资料相匹配。本研究经本院伦理委员会批准，患者均知情同意。

1.2 MMP-3 mRNA表达检测 采用Real-time qRT-PCR法。①标本处理：收集手术切除的结肠癌组织及其配对癌旁正常结肠组织，置于液氮中，-80 ℃冰箱冻存。②RNA提取：取冰冻组织标本100 mg，液氮下研磨、匀浆化，加入TRI Reagent 1 mL，用氯仿和异丙醇依次超速离心抽提，总RNA用焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶解后，用DNase Ⅰ去除总RNA中的基因组DNA。用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA条带，并用分光光度计检测总RNA纯度和浓度。③cDNA合成和mRNA检测：取总RNA 2 μg，70 ℃变性5 min；在20 μL终反应体系[Oligo(dT)180.5 μg，1×第一链合成缓冲液，RNase酶抑制剂20 U，10 mmol/L each dNTP,H Minus M-MuLV逆转录酶200 U，DEPC水]中42 ℃逆转录1 h。采用iCycler iQ实时定量PCR仪进行Taqman探针法Real-time qPCR扩增。引物序列：MMP-3上游引物5′-GAACCTGTCCCTCCAGAACCT-3′，下游引物5′-CGCCAAAAGTGCCTGTCTTTAA-3′；内参基因(ACTB)上游引物5′-GACTACCTCATGAAGATCCTCACC-3′，下游引物5′- CCATCTCTTGCTCGAAGTCCAG-3′。探针序列：MMP-3：ACGCCAGCCAACTGTGATCCTGCT，

ACTB：CGGCTACAGCTTCACCACCACGGC。引物序列由北京奥科生物技术有限公司合成，探针序列由北京赛百盛基因技术有限公司合成。反应条件：95 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40个循环，最后72 ℃延伸10 min。每个样品做2个平行反应，肿瘤组织平行反应Ct值相差小于0.5，正常组织相差小于1。根据Ct值用扩增效率校正相对定量法公式[5, 6]，计算出每个样品经看家基因ACTB标准化的基因表达量。考虑到正常左半、右半结肠组织中MMP-3的本底表达量可能存在差异，以MMP-3 mRNA在结肠癌组织和正常结肠组织中的比值，即表达指数(F)表示结肠癌组织中MMP-3 mRNA的相对表达量。最后PCR扩增产物测序验证。以F的中位数为界将患者分为MMP-3 mRNA高表达者和低表达者，分析不同MMP-3 mRNA表达与结肠癌患者临床病理参数及预后的关系。

1.3 随访 随访截至2013年3月，观察患者复发、转移和生存状况。

2 结果

2.1 不同结肠组织中MMP-3 mRNA表达比较 RSCC组MMP-3 mRNA表达量为(1.01±2.83)×10-3，其配对癌旁正常结肠组织为(4.50±8.06)×10-5；LSCC组MMP-3 mRNA表达量为(4.20±44.4)×10-3，其配对癌旁正常结肠组织为(8.50±29.60)×10-5。RSCC组和LSCC组MMP-3 mRNA表达均显著高于其配对癌旁正常结肠组织(P均<0.01)。RSCC组MMP-3 mRNA的相对表达量为24.87±52.11，LSCC组为90.23±112.70，两组比较P<0.01。RSCC组MMP-3 mRNA高表达者及低表达者分别为12、28例， LSCC组分别为28、12例。

2.2 不同MMP-3 mRNA表达与结肠癌患者临床病理参数的关系 RSCC组MMP-3 mRNA高表达者及低表达者年龄分别为(57.8±12.9)、(55.5±11.1)岁，肿瘤最大直径分别为(4.3±2.0)、(5.4±2.2)cm，二者比较P均>0.05。LSCC组MMP-3 mRNA高表达者与低表达者年龄分别为(59.8±12.2)、(59.3±8.5)岁，肿瘤最大直径分别为(4.4±1.9)、(3.7±1.3)cm，二者比较P均>0.05。RSCC组与LSCC组MMP-3 mRNA高表达者与脉管癌栓和异时性远处脏器转移均显著相关(P均<0.05)； MMP-3 mRNA高表达还与LSCC患者肿瘤浸润深度和癌相关死亡有关。不同MMP-3 mRNA表达与结肠癌患者临床病理参数的关系见表1。

2.3 不同MMP-3 mRNA表达者生存情况 所有患者随访时间7～71个月、平均39.2个月。Kaplan Meier生存分析显示，两组40例MMP-3 mRNA高表达者中位生存时间为46.8个月，40例低表达者中位生存时间为64.3个月，二者比较P<0.01。进一步分层分析发现，LSCC组 MMP-3 mRNA低表达者中位生存时间为64.0个月，高表达者为45.7个月，二者比较P<0.05；RSCC组低表达者与高表达者中位生存时间比较无明显统计学差异(P>0.05)。见插页Ⅰ图1。

3 讨论

由于LSCC和RSCC的致癌机制不用，有研究将二者作为不同类型的肿瘤，并认为其内部存在许多差异表达的基因[7,8]。MMP-3是基质金属蛋白酶家族中的间充质溶解素之一。原位杂交技术证实，MMP-3不是肿瘤细胞合成的，而是由间质的纤维母细胞产生，尤其在出现侵袭的癌细胞最明显，合成后即直接转移到癌细胞表面， 赋予癌细胞浸润所需的蛋白酶。MMP-3不仅可通过直接降解肿瘤细胞外基质成分(如纤维连接蛋白、层黏连蛋白以及Ⅲ、Ⅳ、Ⅸ、Ⅹ型胶原等)发挥作用，还可间接通过激活MMP-9发挥作用;其不仅与CRC的转化有关[9]，还可参与其侵袭和转移[3]。因而MMP-3是与CRC预后相关的潜在基因。目前研究认为，MSI CRC和MSS CRC 是不同致癌途径下的两个结肠癌亚群，前者与RSCC，后者与LSCC有关。Moran等[4]研究发现，MMP-3在不同结肠癌亚群中表达不一，其在高度微卫星不稳定(MSI-H)CRC中表达明显低于低度微卫星不稳定/微卫星稳定(MSI-L/MSS)CRC。推测MMP-3可能是RSCC和LSCC两个不同亚群间潜在差异表达并与患者预后相关的基因。

表1 RSCC组及LSCC组 MMP-3 mRNA表达与患者临床病理参数的关系

本研究结果显示，MMP-3 mRNA在RSCC、LSCC组织中的表达均明显高于其配对的正常结肠组织，与前期在MMP-3蛋白表达水平上的研究相符[10～12]。本研究还发现，LSCC组织中MMP-3 mRNA表达明显高于RSCC组织。Moran等[4]研究发现，CRC组织中MMP-9表达在MSI-H肿瘤中高于其对应的MSI-L/MSS肿瘤，但MSI-H肿瘤中MMP-9的活性却明显低于MSI-L/MSS肿瘤；进一步对MMP-9的前体内源激活物MMP-3的表达进行检测，发现MMP-3在MSI肿瘤中的表达明显低于MSI-L/MSS肿瘤，从而解释了MMP-9在MSI-H肿瘤中较MSI-L/MSS肿瘤表达高但其活性低的原因。研究发现，MMP-3启动子5A多态性是肿瘤形成和进展的危险因素之一[13]。此区域的单核苷酸重复序列是CRC MSI途径易累及的靶结构，MMP-3启动子在这个水平发生的插入/缺失突变见于散发性MSI-H CRC，而且这些移码突变和MMP-3表达下降相关，相反在MSI-L/MSS肿瘤中不存在这种移码突变，证实MMP-3启动子是CRC MSI途径的新靶点[4]。本研究发现，MMP-3 mRNA在RSCC组织中的表达明显低于LSCC组织，推测与RSCC组织中MMP-3启动子的MSI状态有关。

MMP-9是降解Ⅳ胶原最重要的胶原酶之一。通过MMP-3直接激活proMMP-9[14,15]，MMP-9才能导致CRC进展和转移[3]。MMP-3还可通过其蛋白溶解活性释放多种细胞表面分子，如E-cadherin，具有促进肿瘤发展的重要作用[16]。本研究发现，MMP-3 mRNA高表达与脉管癌栓和异时性远处脏器转移的发生密切相关；与LSCC患者肿瘤浸润深度和癌相关死亡显著相关，而在RSCC患者中则无相关性。本研究还发现， MMP-3 mRNA高表达者生存时间明显低于低表达者；分层分析发现，MMP-3 mRNA高表达与LSCC患者预后较差有关，而与RSCC患者预后无关。

综上所述，MMP-3 mRNA在LSCC组织中的表达明显高于RSCC组织；MMP-3 mRNA高表达仅是LSCC患者的不良预后因子。

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Differential expression of MMP-3 mRNA in left-sided and right-sided colon cancer and its relationships with clinicopathological parameters and prognosis

XUKaiyu,LIANZhengjie,WUJiangping,GAOHong,DINGLei

(BeijingShijitanHospitalofCapitalMedicalUniversity,Beijing100038,China)

Objective To investigate the expression of matrix metalloproteinase 3 (MMP-3) mRNA in the left-sided and right-sided colon cancer and its relationships with clinicopathological parameters and prognosis. Methods Eighty patients with colonic adenocarcinoma were divided into the left-sided colon cancer (LSCC) group and right-sided colon cancer (RSCC) group with forty patients in each by the boundary of splenic flexure. Eighty paired specimens were collected from each patient’s cancer tissues and itself normal colon mucosal tissues. The mRNA expression of MMP-3 was detected in two subgroups by real-time quantitative RT-PCR. Subsequently, the relationships between the expression and clinicopathological parameters as well as prognosis of each subgroup were analyzed. Results The mRNA expression of MMP-3 in the colon cancer tissues was significantly higher than that in the normal colon mucosa, and the MMP-3 mRNA expression in LSCC was higher than that in RSCC (P<0.01). In the Pearsonχ2test, the high expression of MMP-3 was closely related with lymphatic/vascular invasion and metachronous distant metastasis for both RSCC and LSCC (allP<0.05). The high expression of MMP-3 mRNA was also closely related with depth of invasion and cancer-related death of LSCC patients (allP<0.05). Kaplan-Meier analysis showed that the high MMP-3 mRNA expression group had the poorer median survival time than that of the low expression group (P<0.01), and the stratification analysis showed the median survival time of RSCC patients with high expression of MMP-3 was less than that of low expression one (P<0.05). The expression of MMP-3 mRNA had no effect on the prognosis of patients (P>0.05). Conclusion The expression of MMP-3 mRNA in the LSCC tissues is significantly higher than that in RSCC tissues, and the high expression of MMP3 is only a poor prognostic factor for LSCC patients.

left-sided colon carcinoma; right-sided colon carcinoma; matrix metalloproteinase 3; clinicopathological parameter; prognosis

国家自然科学基金资助项目(81372585)；第46批教育部“留学回国人员科研启动基金”。

许开宇(1973-)，男，博士，研究方向为胃肠肿瘤。E-mail：xvkaiyv@sina.com

丁磊(1971-)，男，主任医师，研究方向为结直肠癌的基础和临床。E-mail：dinglei1005@126.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.24.001

R735.3

A

1002-266X(2016)24-0001-04

2016-04-20)