2013年云南省H9N2亚型禽流感病毒两个进化分支毒株抗原性变异分析

石凤海，胡媛媛，张文东，孔　强，张应国, 范泉水,赵焕云*，张富强*

(1.临沧市动物疫病预防控制中心，云南临沧 677000;2.云南农业职业技术学院,云南昆明 650031;3.云南省动物疫病预防控制中心,云南昆明 650201;4.云南农业大学,云南昆明 650223;5.成都军区疾病预防控制中心,云南昆明 650032 )



2013年云南省H9N2亚型禽流感病毒两个进化分支毒株抗原性变异分析

石凤海1△，胡媛媛2△，张文东3，孔强4，张应国3, 范泉水5,赵焕云3*，张富强5*

(1.临沧市动物疫病预防控制中心，云南临沧 677000;2.云南农业职业技术学院,云南昆明 650031;3.云南省动物疫病预防控制中心,云南昆明 650201;4.云南农业大学,云南昆明 650223;5.成都军区疾病预防控制中心,云南昆明 650032 )

摘要：为明确2013年云南省H9N2亚型禽流感病毒Ⅲ-1和Ⅲ-2小分支间是否存在抗原性差异,以及这种抗原性差异是否与氨基酸位点变异有关，从2个小分支中选取7个毒株与疫苗株进行系统发育分析和血清学交叉比对试验。结果表明，2个小分支HA基因核苷酸序列同源性为86.6%～98.4%，与2000年前疫苗株亲缘关系较远，Ⅲ-1分支与2000年后疫苗株(ACKLGQ113和ACKDL2010)亲缘关系较近。血清学交叉比对试验结果经统计学分析显示，Ⅲ-1和Ⅲ-2小分支间抗原性存在差别。氨基酸比对结果表明，不同进化亚分支毒株与疫苗株相比氨基酸存在变异；与已报道的抗原表位关键性位点相比，Ⅲ-1分支中部分毒株抗原表位关键性位点存在变异，Ⅲ-2分支毒株无变异，但在其他8个氨基酸位点存在特有变异，是否存在未知抗原表位关键性位点，以及其他氨基酸位点变异是否会辅助性影响抗原变异，还有待进一步研究。

关键词：禽流感病毒；H9N2亚型；进化分支；抗原性变异分析

H9N2亚型禽流感病毒为低致病性禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)，主要引起以家禽呼吸困难、腹泻、产蛋下降等症状为主的疾病，当继发细菌感染时可引起较高的病死率[1-2]。我国自1994年首次从鸡群中分离到H9亚型禽流感病毒以来[3]，绝大部分省市均有H9N2亚型禽流感病毒的流行，给我国养禽业造成严重经济损失。1998年后又先后从猪和人体内分离到H9N2 亚型禽流感病毒[4]。随着H9N2亚型禽流感病毒疫苗的广泛使用，H9N2亚型禽流感在我国的流行已迅速得到控制，但局部地区仍有流行，甚至在已免疫的鸡群中长期持续存在，以温和性和隐性感染为主。有研究证实，频繁的疫苗免疫接种可导致H9N2亚型AIV HA抗原漂移，引起疫苗免疫失败[5-8]。

已有研究表明[9]，2013年云南H9N2亚型禽流感病毒株HA基因属于欧亚分支的类A/Chicken/BeiJing/1/1994亚分支，且又进一步划分为Ⅲ-1和Ⅲ-2两个小分支，Ⅲ-1分支为云南省2008年和2009年H9N2亚型病毒株的延续，Ⅲ-2分支为云南省新出现的进化分支；与云南省现用疫苗株相比，HA推导氨基酸序列中存在多个氨基酸位点差异；Ⅲ-1与Ⅲ-2分支存在具有一定进化(亚)分支特异性变异；部分抗原表位关键性氨基酸存在变异。

为进一步了解Ⅲ-1和Ⅲ-2分支间是否存在抗原性差异、具有一定进化(亚)分支特性的氨基酸位点变异、抗原表位关键性氨基酸位点变异是否会影响禽流感病毒的抗原性，以及云南省现用疫苗株对目前流行毒株是否具有良好的保护性，本研究选取2013年云南省H9N2 AIV Ⅲ-1和Ⅲ-2分支中的7个毒株与现用疫苗株进行系统发育分析，同时将7个毒株与某养殖场健康鸡群血清进行血清学交叉试验，分析抗原性变异情况，以便为云南省禽流感防控及制苗种毒更新提供科学依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1毒株7株H9N2亚型禽流感病毒株(表1)，均为2013年云南省禽流感病毒监测阳性毒株，其中ACKPE621113、ACKZT221113、ADKKM681113属于Ⅲ-1分支，ACKKM300113、ACKDL100513、ACKDp20113、ACKBN380113属于Ⅲ-2分支[9]。

1.1.2抗原和血清H9N2亚型禽流感病毒血凝抑制试验标准抗原、标准阳性血清,购自哈尔滨维科生物技术开发公司。14份血清随机采自云南省某养殖场健康鸡群。

表1　2013年云南省H9N2亚型禽流感病毒

1.2方法

1.2.1抗原制备将7株毒株分别接种到9 d SPF鸡胚中，获取尿囊液，甲醛灭活后作为抗原备用。

1.2.2血清学交叉试验与抗原性分析1组～8组分别为H9N2标准抗原、ACKPE621113、ACKZT221113、ADKKM681113、ACKKM300113、ACKDL100513、ACKDp20113、ACKBN380113病毒株抗原，1组～8组抗原分别与标准阳性血清和随机采集的云南省某养殖场的14份血清进行血清学交叉试验，血清学交叉试验参照GB/T 18936—2003标准操作。采用JMTJFX简明统计分析10.34对不同组血清学交叉试验结果进行数据统计分析。

1.2.3同源性及系统发育分析采用MEGA6软件对7株毒株与疫苗株的HA基因序列进行系统发育分析，用软件中的Construct/Test Maximum Likelihood Tree功能构建系统发育树，参考毒株见表2。

1.2.4氨基酸位点变异分析采用DNAMan软件对2个进化小分支毒株与疫苗株进行氨基酸位点比对，分析各小分支氨基酸位点的一致性及特异性变异、抗原关键性位点氨基酸的变异情况。

表2　序列比对及系统发育分析中引用的H9N2亚型AIV参考毒株

2结果

2.1同源性及系统发育分析

7株H9N2亚型禽流感病毒株及疫苗株的HA基因序列与欧亚分支中的类A/Chicken/BeiJing/I/1994(分支Ⅲ)分支代表毒株ACKBJ194和ADKHKY28097亲缘关系比较近，同源性为90.4%～96.8%，与欧亚分支中的其他2个分支(类A/Quail/Hong Kong/G1/97(分支Ⅱ)、类A/Duck/Hong Kong/Y439/97(分支Ⅰ))代表毒株亲缘关系较远，同源性分别为85.8%～92.6%、81.0%～84.8%；7株H9N2亚型病毒株HA基因序列同源性为86.6～99.3%，与ACKGDSS94、ACKSD696、ACKSHF98疫苗株亲缘关系较远，同源性分别为90.1%～90.8%、89.4%～90.2%、89.1%～90.0%；ACKPE621113、ACKZT221113、ADKKM681113毒株与ACKLGQ113和ACKDL2010疫苗株亲缘关系较近，同源性分别为96.1%～96.4%、94.7%～95.5%，ACKKM300113、ACKDL100513、ACKDp20113、ACKBN380113毒株与ACKLGQ113和ACKDL2010疫苗株亲缘关系较远，同源性分别为86.6%～87.3%、87.4%～88.2%。

系统发育分析表明，2013年云南H9N2亚型病毒株与疫苗株同属于欧亚谱系中的类A/Chiken/BeiJjing/I/1994分支(分支Ⅲ)，其中ACKPE621113、ACKZT221113、ADKKM681113毒株与ACKLGQ113和ACKDL2010疫苗株同属Ⅲ-1分支，ACKKM300113、ACKDL100513、ACKDp20113、ACKBN380113属于Ⅲ-2分支(图1)。

图1　2013年云南省H9N2亚型禽流感病毒HA基因系统发育分析

2.2血清学交叉试验与抗原性分析

结果见表3和表4。前4组的血凝抑制效价低于后4组。按照P>0.05为差异不显著，P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著的判定标准，第1～4组、第5～8组间抗原性差异不显著；第1、2组与第5～6组、第4组与第8组间抗原性差异显著；第3组与第5～8组、第4组与第5～7组间抗原性差异极显著。

2.3氨基酸位点变异分析

氨基酸序列分析结果见表5和表6。

表3　血清学交叉试验结果

表4　生物统计分析结果

表5结果显示，2013年云南7份H9N2亚型病毒株HA氨基酸序列与ACKGDSS94、ACKSD696、ACKSHF983疫苗株存在多个氨基酸位点差异，其中HA在G90(E)、G92(R)、S183(N)、T213(A)、V224(L)、Q234(L)、N282(K)、V318(I)、M469(V)、K501(Q)位点存在一致变异，云南省Ⅲ-1分支毒株和ACKLGQ113、ACKDL2010疫苗株与ACKSD696疫苗株相比在N63(S)、M107(L)、R180(Q)、G181(E)、D216(E)、V253(I)、S283(R)、N285(S)、V287(T)、V320(I)、A334(S)、R505(K)位点存在一致变异，云南省Ⅲ-1分支毒株和ACKLGQ113与ACKSD696疫苗株相比在S127(R)、A198(V)、Q235(M) 位点存在一致变异， ADKKM681113、ACKPE621113毒株与疫苗株ACKLGQ113、ACKDL2010和ACKSD696相比在L89(W)、Q130(R)、Q164(K)、T204(A)、G270(R)、A451(S) 位点存在一致变异，Ⅲ-2与ACKSD696疫苗株和Ⅲ-1分支相比对在H66(R)、L78(I)、L88(P)、T138(S)、S269(L)、N420(D)、E477(D)、D484(N) 位点存在一致变异(表5)。Ⅲ-1分支ADKKM681113 、ACKPE621113毒株在S143(T)、D153(G)、N201(D)抗原关键性位点存在变异，Ⅲ-2分支毒株在已报道的抗原关键性位点未发生变异[10](表6)。

表6　2013年云南省禽流感H9N2亚型病毒抗原

3讨论

刘红旗等[5]连续3年对某鸡场AIV感染鸡群进行跟踪监测，发现1998年的疫苗株对2000年毒株的保护力不及对1999年毒株的保护力。Suarez D L等[8]提出禽流感病毒的变异会引起疫苗免疫的失败。本试验同源性分析结果表明，2013年云南省禽流感H9N2亚型毒株HA基因序列与2000年以前疫苗株亲缘关系较远，云南省Ⅲ-1毒株与2000年以后疫苗株(ACKLGQ113、ACKDL2010)亲缘关系较近，同属于Ⅲ-1分支，云南省新出现Ⅲ-2分支与5个疫苗株均不在同一分支，提示云南省H9N2亚型禽流感病毒已发生变异，需要密切关注当前疫苗的免疫保护情况。 HI交叉试验生物统计分析表明，2013年云南省Ⅲ-1分支毒株与Ⅲ-2分支毒株间存在显著或极显著差异，表明Ⅲ-1与Ⅲ-2分支间存在抗原性差异。

针对2013年云南省H9N2亚型禽流感毒株和疫苗株HA氨基酸位点比对发现，2013年云南省H9N2亚型禽流感毒株与2000年以前疫苗株相比，有10个位点均发生氨基酸替代，Ⅲ-1 分支毒株与2000年后疫苗株有多个氨基酸位点存在一致性氨基酸替代，但部分毒株( ADKKM681113 、 ACKPE621113 )有6个氨基酸位点存在特有的氨基酸替代，Ⅲ-2分支毒株与Ⅲ-1分支和疫苗株相比对，有8个氨基酸位点存在特有的氨基酸替代，这种替代具有一定的进化(亚)分支特异性。2013年云南省毒株与已报道的HA蛋白抗原表位关键性氨基酸位点相比较，Ⅲ-1分支中部分毒株(ADKKM681113 、ACKPE621113)抗原关键性位点存在变异；Ⅲ-2分支毒株与疫苗株一致，但在其他8个氨基酸位点存在特有的氨基酸替代。提示是否存在未知抗原表位关键性位点，以及其他氨基酸位点变异是否会辅助性影响抗原变异，还有待于进一步研究。

血清学交叉试验结果显示Ⅲ-1分支的血清抗体滴度明显低于Ⅲ-2分支的血清抗体滴度。推测所采用的血清抗体非疫苗株诱导产生，有可能是变异株诱导产生，但也不排除养殖场采用其他疫苗株免疫。

参考文献:

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Antigenic Variation Analysis of Two Evolutionary Branches of H9N2 Subtype Avian Influenza Viruses from Yunnan Province in 2013

SHI Feng-hai1,HU Yuan-yuan2,ZHANG Wen-dong3, KONG Qiang4,ZHANG Ying-guo3,FAN Quan-shui5, ZHAO Huan-yun3, ZHANG Fu-qiang5

(1.CentreforAnimalDiseasePreventionandControl,LincangCity,Lincang,Yunnan,677000,China;2.YunnanVocationalandTechnicalCollegeofAgriculture,Kunming,Yunnan,650031,China;3.CentreforAnimalDiseasePreventionandControl,YunnanProvince,Kunming,Yunnan,650201,China;4.YunnanAgricultureUniversity,Kunming,Yunnan,650223,China;5.CentreforDiseasePreventionandControl,ChengDuMilitaryRegion,Kunming,Yunnan,650032,China)

Abstract:In order to investigate the antigenic differences between Ⅲ-1 and Ⅲ-2 of the H9N2 subtype AIV in Yunnan province in 2013,and whether the antigenic difference is related to the amino acid mutation,7 virus strains and vaccine strains were analyzed by phylogenetic analysis and serological cross test.The results showed that:the homologies of HA gene of the two subgroup strains were 86.6 % to 98.4%, the relationship was far with the vaccine strains before 2000,Ⅲ-1 strains were near with the vaccine strains (ACKLGQ113 and ACKDL2010)after 2000.The HI cross test results by statistics analysis showed that the antigenicity differences exist between Ⅲ-1 and Ⅲ-2 subgroups.Amino acid comparative analysis result showed that variations in different subgroup strains exist;compared with the antigenic epitope sites reported,the variation existed in parts of Ⅲ-1 strains and in Ⅲ-2 strains is no change,but there are unique variations in eight other amino acid sites of Ⅲ-2 strains,whether there is any unknown antigen epitope sites,or the other ancillary amino acid sites whether can affect antigen variation,have yet to be further studied.

Key words:Avian influenza virus;H9N2 subtype;different evolutionary branch;antigenic variation analysis

文章编号:1007-5038(2016)04-0006-06

中图分类号:S852.695.2

文献标识码:A

作者简介：石凤海(1968-)，男，云南临沧人，高级兽医师，主要从事动物疫病防治工作。胡媛媛(1977-)，女，吉林梅河口人，讲师，主要从事分子病毒学研究。△同等贡献作者。*通讯作者

基金项目：云南省科技计划项目(2012CH002)；国家公益性行业专项(201103008)；军队科技计划项目(CWS12J075、13BJYZ37、A12005)

收稿日期：2015-09-11