多西环素人工抗原的合成与鉴定

米克热木·沙衣布扎提，孟坤杰，王　剑

(1.新疆农业大学动物医学学院，新疆乌鲁木齐 830052；2.陕西理工学院生物科学与工程学院，陕西汉中 723001)



多西环素人工抗原的合成与鉴定

米克热木·沙衣布扎提1，孟坤杰1，王剑2

(1.新疆农业大学动物医学学院，新疆乌鲁木齐 830052；2.陕西理工学院生物科学与工程学院，陕西汉中 723001)

摘要：建立多西环素人工抗原(Doxycycline，DOX)的合成及鉴定方法。采用戊二醛偶联法将DOX分别与载体牛血清白蛋白(BSA)及卵清蛋白(OVA)偶联制备免疫抗原(DOX-BSA)和包被抗原(DOX-OVA)。经SDS-PAGE电泳法、紫外可见吸收光谱鉴定，证实人工抗原成功合成，偶联比分别为8.6∶1和 3.8∶1。结果表明建立了一种新的DOX抗原合成方法，为进一步制备特异性DOX抗体和建立检测食品中DOX的酶联免疫方法奠定了基础。

关键词：多西环素；人工抗原；偶联比

多西环素(doxycycline，DOX)属于常见的四环素类抗菌药，具有高效、长效、广谱等优点，被广泛直接用作治疗或预防性兽药或饲料添加剂，如针对预防治疗沙门菌，大肠埃希菌感染以及猪支原体肺炎等多种感染性疾病[1-3]。在动物养殖生产中，往往存在抗菌药物滥用的现象，如频繁或随意加大抗菌药物的使用剂量，造成抗菌药物在动物性食品中严重残留。四环素类药物长期残留在动物组织中，长期食用残留有这类药物的动物产品，会严重损害人体健康。其毒性主要表现为对人体多器官的损害，并伴有生殖毒性，甚至能够诱导耐药菌株的产生[4]。中国“动物性食品中兽药最高残留限量”规定，肌肉、肝脏以及肾脏组织中DOX的最高残留限量分别为0.1、0.3、0.6 μg/mL[5]。因此，通过建立一种快速、简便、准确检测动物性食品中多西环素残留的方法，对加强和管理动物性食品中多西环素的残留检测具有重要意义。

近年来，DOX残留检测越来越受到人们的关注，目前常见的DOX残留检测方法有紫外分光光度法、薄层色谱、荧光分析法、高效液相色谱以及高效液相色谱-串联质谱法等方法[6-8]。虽然这些方法具有检测准确性高的优点，并且在定性、定量分析上具有良好的特性，然而诸如此类的传统方法一般在操作条件上要求较高，如需要繁琐的操作、昂贵的仪器以及经过专业培训的操作人员，很难以满足同时对大批量样品进行高通量的快速残留检测。基于抗体工程的免疫分析技术因其具有灵敏性高、特异性高、快速性、简便性以及样品使用量少等优点在药物残留检测方面被广泛开发利用[9]。目前，针对此类抗菌药物的检测有针对四环素类免疫学检测技术，而单独针对DOX免疫学检测方法很不完善。虽然已有DOX的ELISA检测试剂盒，如德国Bio-pharm公司的酶联免疫检测试剂盒和中国的“多西环素残留的ELISA检测方法及试剂盒与应用”。但出于成本与灵敏性等因素的局限性，以及为了能够保证食品安全这一民生问题，研发一种能够针对DOX残留进行高通量快速免疫学方法，具有十分重要的应用价值和极大的推广空间。在本研究中，针对DOX小分子不能够激发机体的免疫应答这一特性，建立DOX完全人工抗原的合成方法，并对合成产物进行鉴定，为针对DOX制备高特异性的抗体并进一步应用在免疫学试验方法中奠定了理论与实践基础。

1材料与方法

1.1材料

多西环素，西乡药业公司产品；牛血清白蛋白(BSA，99%)，科邦生物公司产品；鸡卵白蛋白(OVA，98%)，Sigma公司产品；戊二醛、氯化钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钾、氢氧化钠、盐酸，成都市科隆化工试剂厂公司产品。

1.2方法

1.2.1DOX人工抗原合成

1.2.1.1免疫抗原DOX-BSA制备称取10.94 mg DOX溶于1 mL DMF，磁力搅拌下加入BSA(13.6 mg BSA溶于4 mLPBS)，并搅拌逐滴加入50 μL 250 g/L戊二醛溶液，pH调到8～9。4℃搅拌约16 h，3 000 r/min离心10 min，收集上清。

1.2.1.2包被抗原DOX-OVA制备称取15 mg DOX溶于1 mL DMF，磁力搅拌下加入OVA(12 mg OVA溶于4 mL PBS)，并搅拌逐滴加入50 μL 250 g/L戊二醛溶液，pH调到8～9。4℃搅拌约16 h，3 000 r/min离心10 min，收集上清。

将收集的免疫抗原和包被抗原上清液在PBS缓冲液中透析3 d，每12 h换一次液，透析后收集，置-20℃保存备用，合成路线见图1。

图1　DOX人工抗原合成路线图

1.2.2DOX人工抗原的鉴定SDS-PAGE鉴定人工抗原，采用普通电泳方法，SDS-PAGE法制备50 g/L浓缩胶和120 g/L分离胶。考马斯亮蓝染色2 h，置脱色液中脱色至条带清晰。

使用紫外光谱法对合成的DOX完全人工抗原进行鉴定，并通过公式计算抗原偶联比。通过用磷酸盐缓冲液将所选搭载小分子的蛋白载体(BSA和OVA)、DOX和DOX人工抗原(根据载体蛋白的不同分为包被原与免疫原)分别稀释浓度为0.2、0.02、0.2 mg/mL，在200 nm～400 nm波长下进行全波长扫描。根据人工抗原特征吸收波长281 nm处的吸光度计算半抗原与载体蛋白的偶联比，公式如下[10]：

偶联比=[(A偶联物-A载体蛋白)×ρ半抗原×M蛋白质]/[A半抗原×M半抗原×ρ载体蛋白]

式中：A为吸光度；M为相对分子质量； ρ为质量浓度(mg/mL)。

2结果

2.1DOX人工抗原蛋白电泳鉴定结果

SDS-PAGE电泳鉴定结果显示,DOX人工抗原(DOX-BSA和DOX-OVA)条带分别相比BSA/OVA条带有明显的弥散现象，说明BSA/OVA不同程度成功偶联一定量的DOX，致使合成的免疫原和包被抗原的分子质量较BSA/OVA大，导致合成的免疫抗原和包被抗原的SDS-PAGE 电泳谱带迁移速率不一(图2)。

2.2DOX人工抗原蛋白紫外鉴定结果

DOX人工抗原(DOX-BSA，DOX-OVA)及其载体与DOX的紫外扫描曲线图(图3)。通过分析可知，在281 nm处的完全人工抗原与载体蛋白(BSA和OVA)的紫外吸收光谱相比，DOX的吸收曲线向左发生一定的位移，同时DOX-BSA/OVA右侧吸收峰都发生了改变，说明载体蛋白上已成功连接了一定数量的DOX。根据人工抗原、载体蛋白及DOX 的紫外吸收曲线在281 nm 处的紫外吸光值，计算出戊二醛法合成的DOX人工抗原中，DOX与载体蛋白BSA和OVA的结合比分别为8.6和3.8。

M.蛋白分子质量标准;1.BSA;2.DOX-BSA;3.OVA;4.DOX-OVA

M.Protein molecular weight Marker;1.BSA;2.DOX-BSA;3.OVA;4.DOX-OVA

图2DOX人工抗原及其载体的SDS-PAGE结果

Fig.2SDS-PAGE results of

DOX artificial antigens and their vectors

3讨论

DOX作为一种分子质量较小的小分子化合物，只具备抗原的反应原性，而没有抗原的免疫原性，这些小分子抗原只有与一定大小的载体蛋白进行偶联(必须保证不破坏小分子抗原中的结构特异性)，形成新的大分子物质后，才能刺激动物机体产生特异性免疫应答反应进而产生抗体。在偶联过程中，偶联的小分子自身应该具有或通过反应可衍生出能与载体蛋白上基团进行偶联反应的必须基团(氨基、羧基、重氮盐、羟基等)，只有具备这种条件才能实现小分子与载体蛋白的连接[11]。DOX分子结构的外部基团有一个氨基。因而本试验采用戊二醛偶联法将DOX与载体蛋白进行偶连，合成DOX的人工抗原。

A.BSA;B.OVA

图3DOX人工抗原紫外扫描图

Fig.3UV spectrum of BSA, OVA, DOX and DOX artificial antigens

人工抗原的鉴定有多种方法，如蛋白电泳、紫外分光光度法、红外光谱法以及质谱法等[12-13]。其中，蛋白电泳和紫外分光光度法最为简便易行，且消耗的样品量少，因而常被采用。本试验采用蛋白电泳和紫外分光光度法，两种方法对人工抗原进行了鉴定，二者结果统一，均表明DOX人工抗原成功合成。紫外光谱法判断一种人工抗原是否完成偶联成功，其依据是紫外吸收峰图中是否出现兼有半抗原与载体蛋白紫外光谱的叠加性来判断人工抗原是否成功完成了偶联。对于SDS-PAGE电泳法，则根据最后电泳结果中分子质量的不同，造成合成的人工抗原分子质量较载体蛋白大，致使其迁移率较载体蛋白的速率慢，进行判断人工抗原是否偶联成功。

研究表明，针对小分子半抗原产生的抗体的特异性不仅有整个半抗原分子或部分结构的性质相关，而且往往还与偶联的人工抗原中载体上连接小分子的数量有关[14]。因而，为了最大限度地保证免疫效果，是非常必要的检测合成的人工抗原载体上连接的半抗原数目。较为理想的半抗原偶联比一般从3∶1到45∶1之间，在这个范围内的偶联比可以达到刺激免疫动物的免疫系统产生特异性抗体，试验中获得的免疫抗原与包被抗原的偶联比分别为8.6∶1和3.8∶1，这一结果处于理想范围[15]。因此，通过戊二醛法成功合成了DOX人工抗原，并通过紫外光谱法和蛋白电泳的手段鉴定DOX人工抗原是否成功合成，为下游抗体产品的研发及食品中DOX的酶联免疫检测方法的建立奠定了基础。

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Synthesis and Identification of Doxycycline Artificial Antigens

MIKEREMU Shayi-buzhati1, MENG Kun-jie1, WANG Jian2

(1.CollegeofVeterinaryMedicine,XinjiangAgricultureUniversity,Urumqi,Xinjiang,830052,China;2.CollegeofBiologicalScienceandEngineering,ShaanxiUniversityofTechnology,Hanzhong,Shaanxi,723001,China)

Abstract:To explore a method for the synthesis and identification of doxycycline (DOX) artificial antigens,DOX artificial antigens were synthesized by glutaraldehyde coupling method between DOX and bovine serum albumin (BSA) and ovalbumin (OVA) for preparing immune antigen (DOX- BSA) and envelope antigen (DOX- OVA).DOX artificial antigens were identified by UV spectrophotometry and SDS-PAGE.The results confirmed that the DOX artificial antigens were successfully synthesized.The coupling ratios of DOX hapten and BSA or OVA were 8.6∶1 and 3.8∶1,respectively.In conclusion,this method can be applied for DOX artificial antigen synthesis and provide the basis for the preparation of DOX antibodies and development of DOX immune detection.

Key words:doxycycline;artificial antigen;coupling ratio

文章编号:1007-5038(2016)04-0067-04

中图分类号:S859.7

文献标识码:A

作者简介：米克热木·沙衣布扎提(1960-)，女，新疆伊犁人，副教授，主要从事基础兽医学研究。

基金项目：国家自然科学基金项目(31460677)

收稿日期：2015-09-30