异常凝血酶原和唾液酸在慢性肾功能不全患者血清中的表达及临床意义

公 帅，孙桂荣，刘明军，席 强，彭 冲，孙晓岚

(青岛大学附属医院检验科，山东青岛 266003)

·论 著·

异常凝血酶原和唾液酸在慢性肾功能不全患者血清中的表达及临床意义

公 帅，孙桂荣△，刘明军，席 强，彭 冲，孙晓岚

(青岛大学附属医院检验科，山东青岛 266003)

目的 观察慢性肾功能不全对血清异常凝血酶原(PIVKA-Ⅱ)和唾液酸(SA)水平的影响。方法 用化学发光法和酶法分别检测127例慢性肾功能不全、32例肾功能正常肾脏疾病患者、57例体检健康者和120例肝细胞癌(HCC)患者血清PIVKA-Ⅱ和SA水平。分别测定上述受试者血清尿素(Urea)和肌酐(Cr)水平，并估算肾小球滤过率值(eGFR)。结果 健康对照组、肾功能正常疾病组和肾功能不全疾病组三组间血清PIVKA-Ⅱ水平没有统计学差异(H=2.902,P>0.05)，且明显低于HCC组(U值分别为319.50、203.00、665.50，P均<0.001)。肾功能不全疾病组中各期之间血清PIVKA-Ⅱ水平也没有统计学差异(H=3.991,P>0.05)。血清SA水平在健康对照组、肾功能正常疾病组和肾功能不全疾病组之间 (H=63.685,P<0.001)，以及在肾功能不全疾病组各期之间(H=64.689，P<0.001)均有统计学差异。血清SA水平与eGFR呈负相关(r=-0.705,P<0.001)，与Urea、Cr水平呈正相关(r=0.599、0.704，P<0.001)。HCC组血清SA水平较CKD1～4期均明显升高(U值分别为126.00、163.50、247.00、715.00，P均<0.001),较CKD5期无明显变化(U= 419.00，P>0.05)。结论 肾功能不全对血清PIVKA-Ⅱ表达无明显影响，但可明显提高血清SA的表达水平，并与肾功能损害程度密切相关。可见血清SA水平升高不仅对HCC及其他多种恶性肿瘤有辅助诊断价值，还可较好地反映慢性肾功能不全患者的肾功能状态。

慢性肾功能不全； 维生素K缺乏诱导蛋白; 唾液酸； 尿素; 肌酐

维生素K缺乏诱导蛋白(protein induced by vitamin K absence or antagonist-Ⅱ，PIVKA-Ⅱ)，又称异常凝血酶原，是继AFP临床应用半个多世纪以来，又一个对肝细胞癌(HCC)的诊断、肿瘤分期、疗效监测和预后判定均具有重要临床价值的血清学标志物，敏感性和特异性高，与AFP联合检测可更早发现HCC[1-3]。也有学者报道炎症性肠病和冠状动脉钙化患者的血清PIVKA-Ⅱ水平升高，同时可间接反映体内维生素K的缺乏[4-5]。据文献报道，慢性肾病(CKD)患者往往伴有维生素K的缺乏[6]，其血清PIVKA-Ⅱ水平也升高，且升高程度随肾功能损害程度的加重而逐渐升高[7]。但有学者对接受和未接受血液透析的两组CKD患者血清PIVKA-Ⅱ水平进行研究发现[8-9]，肾功能及肾小球滤过率对血清PIVKA-Ⅱ的表达无明显影响。有关中国慢性肾功能不全患者血清PIVKA-Ⅱ的表达情况尚不清楚。因此，有必要对中国人群血清PIVKA-Ⅱ水平与肾功能之间的相关性进行研究。

唾液酸(sialic acid，SA)是真核细胞膜上糖蛋白的主要成分，广泛分布于哺乳动物体内，是一系列含有9个碳原子羟基化单糖酰化衍生物的统称，通常位于糖蛋白和糖脂的寡糖侧链的终端位置，是糖复合物结构和功能多样化的重要物质基础，在体内生物代谢过程中起着重要的生理功能，也与多种肿瘤的发生、发展密切相关，是一种非组织细胞特异性的肿瘤标志物[10-11]，其血清水平在老年慢性肾功能不全衰竭期患者表达升高[12]，但这种升高是否出现在肾功能不全的其他分期，是否与肾功能损害程度密切相关还缺乏文献报道。

本研究以健康体检者和肾功能正常疾病组患者分别为对照组，观察肾功能不全各分期患者血清PIVKA-Ⅱ和SA水平变化，并分析两者与eGFR、Urea和Cr水平的相关性，旨在探讨肾功能对血清 PIVKA-Ⅱ和SA水平的影响。

1 资料与方法

1.1 对象与分组

1.1.1 肾功能不全疾病组：根据北京大学第一医院推荐的中国人肾小球滤过率(GFR)公式求得GFR估算值(eGFR)[13-14]，选择2014年9月至2015年3月本院住院的肾功能不全患者127例[eGFR<90 mL·min-1·(1.73 m2)]，男67例，女60例，年龄35～75岁，平均62岁，包括慢性肾小球肾炎23例，肾病综合征41例，高血压肾病42例，糖尿病肾病21例。又进一步依据美国KDOQI指南CKD的定义和分期对CKD患者分为如下4组：CKD 2期(肾功能轻度下降组)，eGFR 60～90 mL·min-1·(1.73 m2)，共32例；CKD 3期(肾功能中度度下降组)eGFR 30～59 mL·min-1·(1.73 m2)，共34例；CKD 4期(肾功能重度下降组)eGFR 15～29 mL·min-1·(1.73 m2)，共31例；CKD 5期(肾功能衰竭组)eGFR < 15 mL·min-1·(1.73 m2)，共30例。

1.1.2 肾功能正常疾病组 即CKD 1期，同期本院住院患者32例[eGFR>90 mL·min-1·(1.73 m2)]，男20例，女12例，年龄33～69岁，平均58岁，包括肾病综合征12例，慢性肾小球肾炎10例，高血压4例，糖尿病6例。

1.1.3 HCC组 另外收集2013年9月至2014年1月本院已确诊为肝细胞癌患者120例，男106例，女14例，年龄40～77岁，平均57岁。

1.1.4 健康对照组 选取2013年9月至2014年1月本院体检健康者57例，男37例，女20例，年龄41～68岁，平均56岁，体格检查，临检常规及血生化检查和影像学检查均正常，排除常见内、外科疾病和代谢性疾病。上述4组间年龄差异无统计学意义(P>0.05),肾功能不全患者组和肾功能正常患者组均排除良恶性肿瘤及肝脏疾病。本研究经青岛大学附属医院伦理委员会批准后实施。

1.2 方法

1.2.1 标本采集及处理 用普通真空采血管或促凝分离胶真空采血管采集受试者晨空腹静脉血3 mL，3 000 r/min离心15 min，分离血清，部分血清用于当天测定血清SA、Urea和Cr，部分血清 -20 ℃冻存，用于血清PIVKA-Ⅱ水平测定。

1.2.2 试剂与仪器 血清PIVKA-Ⅱ浓度测定采用日本富士瑞必欧株式会社生产的LUMIPULSETM G1200全自动免疫分析仪及配套PIVKA-Ⅱ试剂盒、标准品和质控品；血清唾液酸、Urea、Cr浓度测定均采用日本日立公司(Hitachi)生产的7600-210全自动生化分析仪；唾液酸测定试剂盒(酶法)、标准品及质控品均购自浙江东瓯诊断产品有限公司；Urea、Cr试剂盒和标准品购自北京利德曼公司，质控品购自美国Beckman公司。

1.2.3 eGFR计算 记录受试者的性别、年龄和血清Cr水平，根据北京大学第一医院推荐的中国人肾小球滤过率(GFR)公式估算GFR值(eGFR)。公式为eGFR[mL/(min·1.73m2)]=186×[Scr(μmol/L)/88.4]-1.154×(年龄)-0.203×1.233(中国人)×0.724(女性)。

1.3 统计学处理 用SPSS 20.0软件进行。血清SA、PIVKA-Ⅱ水平均呈偏态分布，用中位数(M)和第25、75百分位数(P25～P75) 表示；多组间数据比较采用非参数Kruskal-WallisH检验，组间的两两比较用Mann-WhitneyU检验。血清PIVKA-Ⅱ、SA水平与血清eGFR、Urea以及Cr水平间的相关性用直线相关分析。

2 结 果

2.1 各组血清PIVKA-Ⅱ和SA水平比较 经非参数Kruskal-WallisH检验，健康对照组、肾功能正常疾病组和肾功能不全疾病组3组间血清PIVKA-Ⅱ水平差异无统计学意义(H=2.902,P>0.05)，肾功能不全疾病组中各期之间血清PIVKA-Ⅱ水平差异无统计学意义(H=3.991,P>0.05)。HCC组血清PIVKA-Ⅱ水平较健康对照组、肾功能正常疾病组和肾功能不全疾病组均明显升高(U值分别为 319.50、203.00、665.50，P均<0.001)。在健康对照组、肾功能正常疾病组和肾功能不全疾病组3组间血清SA水平差异有统计学意义(H=63.685,P<0.001)，肾功能不全疾病组血清SA水平明显高于肾功能正常疾病组和健康对照组(U值分别为 769.50、1 278.50，P均<0.001)。其中，CKD 4期血清SA水平明显高于CKD 2、3期(U值分别为172.00、265.00，P均<0.001)，明显低于CKD5期(U=240.50，P<0.001)；CKD 3期血清SA水平明显高于肾功能正常疾病组(U=298.50，P<0.001)和健康对照组(U=492.00，P<0.001 )；CKD 2期血清SA水平明显高于健康对照组(U=584.50，P<0.001)，但与CKD3期(U=436.00,P>0.05)，以及肾功能正常疾病组比较(U=365.50,P>0.05)差异均无统计学意义；肾功能正常疾病组和健康对照组比较差异也无统计学意义(U=834.50,P>0.05)。HCC组血清SA水平与肾功能正常疾病组(U=126.00，P<0.001)和CKD 2、3、4期差异均有统计学意义(U值分别为163.50、247.00、715.00，P均<0.001),与CKD 5期差异无统计学意义(U=419.00，P>0.05)，见表1。

表1 各组血清PIVKA-Ⅱ和SA水平的比较[M(P25～P75)]

a：为与HCC组比较，P<0.001；b：为与健康对照组比较，P<0.001；c：为与肾功能正常疾病组比较，P<0.001；d：为与肾功能不全疾病组中的CKD 2期比较，P<0.001；e：为与肾功能不全疾病组中的CKD 3期比较，P<0.001；f：为与肾功能不全疾病组中的CKD 4期比较，P<0.001。

图1 慢性肾功不全患者血清PIVKA-Ⅱ和SA水平与eGFR(a，d)、Urea(b,e)及Cr(c,f)水平的相关性分析(n=127)

2.2 慢性肾功能不全患者血清PIVKA-Ⅱ、SA水平与eGFR、Urea以及Cr水平间的相关性 经直线相关统计学分析，慢性肾病患者血清PIVKA-Ⅱ水平与血清eGFR、Urea以及Cr水平均无相关关系(相关系数r分别为0.166、-0.173、-0.128，P>0.05)。血清SA水平(Y,mg/dL)与eGFR[X,mL·min-1·(1.73 m2)]呈负相关(Y=-0.351X+78.573,r=-0.705,P<0.001)，与血清 Urea(X，mmol/L)呈正相关(Y=0.943X+51.37，r=0.599,P<0.001),与Cr水平(X，μmol/L)呈正相关(Y=0.03X+55.793，r=0.704,P<0.001)，见图1。

3 讨 论

凝血酶原是在维生素K依赖的γ谷氨酸羧化酶的催化作用下由其前体分子生成。当维生素K缺乏时，凝血酶原前体分子中谷氨酸区域的氨基酸因不能完全被羧化，则生成了异常凝血酶原，即PIVKA-Ⅱ。1984年Liebman等[15]学者首次发现PIVKA-Ⅱ在HCC患者血清中的浓度较健康者和慢性活动性肝炎患者明显升高，近年随着血清PIVKA-Ⅱ测定方法学的进步，以及检测灵敏度和特异度的提高，使得该指标经美国FDA和CFDA批准作为HCC标志物应用于临床。

Voong等[7]学者于2013年研究发现，慢性肾功能不全患者体内存在维生素K的缺乏,其中血液透析患者往往还伴有很严重的血管钙化，此病理变化的产生认为与一种肝外产生的维生素K依赖基质Gla蛋白(MGP)的减少有关，该蛋白本身具有血管钙化抑制作用。血管钙化现象在肾病患者普遍存在，提示这些患者体内可能存在维生素K的缺乏或不足。Voong等[7]学者以肾小球滤过率(GFR)为肾功能的评价指标，观察到血清PIVKA-Ⅱ水平随GFR的下降而升高，血液透析患者血清PIVKA-Ⅱ水平升高更为显著。Katots[8]认为PIVKA-Ⅱ的表达水平的升高并不是血液透析本身引起的，而是由于维生素K的缺乏，因为PIVKA-Ⅱ水平的升高往往与体内维生素K水平降低、患者年龄升高和HDL水平减少相一致，而与血液透析的治疗时间没有关系。本研究根据国人GFR公式求得eGFR，以此(评定肾脏疾病患者肾功能损害的程度，并根据eGFR将患者进行分组，研究结果显示慢性肾功不全患者血清PIVKA-Ⅱ水平较肾功能正常疾病组和健康对照组无明显变化，与Voong等[7]报道的研究结论不一致，究其原因目前尚难解释，可能与彼此采取的肾功能评价指标以及研究对象的种族不同有关，本实验采用的是GFR估算值(eGFR)，在评价肾功损害方面理论上不及GFR,但该值的测定简单易行、成本低、适宜临床广泛应用；另外，不同种族饮食习惯的不同可能也决定肾功能不全患者的维生素K缺乏与否，况且维生素K缺乏引起的PIVKA-Ⅱ表达也是一个剂量和时间依赖性的过程[9-16]，肾病患者体内维生素K的缺乏也容易通过饮食补充得以纠正[7],只要慢性肾病患者保持一个良好的营养状态(稳定的体重、没有蛋白以及皮下脂肪的丢失等)，体内维生素K的含量往往可处于一个较高的水平[17]。

SA是细胞膜和可溶性蛋白的重要组分，对维护细胞的正常生理功能有重要作用，检测血清SA浓度可间接反映细胞结构与功能。当组织发生炎症反应、损伤或细胞代谢异常时，SA从细胞膜脱落或分泌增加，进入组织液或血流，引起血清SA水平的增高。多种恶性肿瘤细胞恶变过程中，细胞膜表面糖蛋白以及糖脂中糖基成分也发生如此变化，从而导致肿瘤患者血清SA水平也明显升高[18-20]。本研究表明，肾功能不全疾病组血清SA水平明显高于肾功能正常疾病组和健康对照组(P均<0.001)。肾功能不全疾病组中各期之间SA水平有显著的统计学差异(P<0.001)。直线相关分析结果显示血清SA水平与血清eGFR水平呈明显的负相关，与血清Urea和Cr水平呈明显的正相关，说明血清SA水平随肾功能损害程度的加重而升高，这可能与肾脏疾病导致肾脏损害、肾小球毛细血管内皮损伤以及管型形成，肾衰时大量的肾小管纤维变性和坏死，大量的SA释放入血有关。HCC组血清SA水平明显高于肾功能正常疾病组和肾功能不全疾病组，提示SA可作为肝癌辅助诊断指标。在排除恶性肿瘤的情况下，血清SA水平的变化对肾脏疾病的病情判断和疗效观察也具有良好的指导作用。

综上，本实验未发现肾功能不全对血清PIVKA-Ⅱ水平有明显的影响，临床应用PIVKA-Ⅱ作为HCC及其他恶性肿瘤的标志物时可忽略肾功能对其的影响，但发现对血清SA水平有明显的升高作用，且与肾功能损害程度有关。目前SA作为肿瘤标志物在临床上广泛应用，临床医生面对阳性结果检验报告时应注意排除肾功能改变引起的假性升高。对非恶性肿瘤患者，血清SA水平检测也有望成为监测慢性肾病病情变化的有用指标。

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Serum expression of PIVKA-Ⅱand SA in patients with chronic renal insufficiency

GongShuai,SunGuirong△,LiuMingjun,XiQiang,PengChong,SunXiaolan

(DepartmentofClinicalLaboratory,AffiliatedHospitalofQingdaoUniversity,Qingdao,Shandong266003,China)

Objective To investigate the impact of chronic renal insufficiency on serum levels of protein induced by vitamin K absence or antagonist-Ⅱ(PIVKA-Ⅱ) and sialic acid (SA).MethodsThe levels of serum PIVKA-Ⅱ,SA,urea and creatinine(Cr) were detected in 127 cases of chronic renal insufficiency,32 cases of renal disease with normal renal function,57 healthy controls undergoing the physical examination and 120 cases of hepatocellular carcinoma(HCC) by using the chemiluminescent and enzymatic methods respectively.The serum urea and creatinine levels were also measured.The estimated GFR (eGFR) was calculated.Results The serum PIVKA-Ⅱ level had no statistical difference in among the healthy control group,renal disease with normal renal function group and renal disease with renal insufficiency group(H=2.902,P>0.05),moreover significantly lower than that in the HCC group (U=319.5，203.00,665.50 respectively,P<0.001).Serum PIVKA-Ⅱ level had no statistical difference among various stages in the disease with renal insufficiency group (H=3.991，P>0.05).However,serum SA levels had statistical differences among the healthy control group,disease complicating normal renal function group and disease complicating renal insufficiency group( H = 63.685，P<0.001),and among the various stages in the disease complicating renal insufficiency group (H=64.689,P<0.001).The serum SA level was negatively correlated with eGFR level (r=-0.705，P<0.001),and positively correlated with Urea and Cr levels (r= 0.599，r= 0.704，P<0.001).The SA level in the HCC group was significantly increased compared with that in the stage 1-4 of chronic kidney disease(CKD) (U=126.00，163.50,247.00,715.00 respectively,P<0.001),but had no obvious change compared with the stage 5 of CKD(U=419.00,P>0.05).Conclusion The renal insufficiency has no obvious impact on serum PIVKA-Ⅱexpression,but could significantly increase the SA expression level,moreover is closely related with the severity of renal function impairment,thus indicating that the SA level increase not only has the assisted diagnosis value on HCC and multiple malignant tumors,but also better reflects the renal function status in the patients with chronic renal insufficiency.

chronic renal insufficiency; PIVKA-Ⅱ; sialic acid; urea; creatinine

公帅，男，在读研究生，主要从事临床免疫学检验研究。△通讯作者，E-mail：sungr@qduhospital.cn。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.07.013 文献标识码：A 文章编号：1673-4130(2016)07-0900-04

2015-11-10)