酪氨酸激酶受体RON在慢性阻塞性肺疾病患者肺组织中的表达及意义

张文波，陈小菊，向小均，冷长燕(川北医学院附属医院呼吸内科，四川南充　637000)



酪氨酸激酶受体RON在慢性阻塞性肺疾病患者肺组织中的表达及意义

张文波，陈小菊，向小均，冷长燕
(川北医学院附属医院呼吸内科，四川南充637000)

【摘要】目的:观察酪氨酸激酶受体RON在慢性阻塞性肺疾病( chronic obstructive pulmonary disease，COPD)患者肺组织中的表达及分布，以探讨RON在人类COPD发病机制中的作用。方法:收集2013年5月至2013年12月在川北医学院附属医院心胸外科因肺癌进行手术治疗的患者，将其分为对照组( 25例)和COPD组( 20例)，于手术切除标本中选取距肺癌病灶5 cm以上的新鲜肺组织。采用免疫组化方法观察两组患者肺内RON蛋白的表达和分布情况。结果: COPD组患者肺组织中肺泡区与支气管区RON蛋白的表达较对照组均明显增强( P＜0. 05)，而且COPD组患者支气管区的RON蛋白表达量多于肺泡区( P＜0. 01)结论: COPD患者肺组织中RON的合成与表达增强，其表达量与患者气流受限严重程度相关。

【关键词】酪氨酸激酶受体RON;慢性阻塞性肺疾病;巨噬细胞刺激蛋白;肺泡巨噬细胞

网络出版时间: 2016-3-4 10∶16网络出版地址: http: / /www.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20160304.1016.002.html

慢性阻塞性肺疾病( chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一种以持续不可逆气流受限且气流受限多呈进行性发展为特征的疾病，与气道和肺组织对有害颗粒或气体的异常慢性炎症反应有关。COPD的炎症由多种炎性细胞、细胞因子及炎症介质介导且相互作用导致。巨噬细胞是COPD气道管壁和管腔的主要炎性细胞之一。酪氨酸激酶受体RON( recepteur d'origine nantais)是巨噬细胞刺激蛋白( macrophage stimulating protein，MSP)的特异性受体，在各种免疫细胞中，RON选择性表达于组织巨噬细胞如肺泡巨噬细胞表面［1］。MSP激活后与RON结合并诱导其生物活性，刺激巨噬细胞释放氧自由基和炎症介质，诱导核因子-κB( nuclear factor kappa B，NF-κB)的活化，调节细胞分化、迁移和基质的侵袭等［2－3］。我们之前的动物实验发现［4］:在烟熏建立的COPD大鼠模型中，COPD大鼠肺组织中RON蛋白及其基因的表达量明显高于正常大鼠，从而在动物实验中证实了RON在COPD发病机制中起一定作用。然而，至今未见RON在人类COPD作用的相关研究文献资料。本实验通过检测RON 在COPD患者肺组织的表达及分布，观察RON是否也在人类COPD发病中起一定作用。

1 　资料与方法

1.1实验对象及分组

收集2013年5月至2013年12月在川北医学院附属医院心胸外科因肺癌进行手术治疗的患者，将其分为对照组( Control) ( 25例)和COPD组( 20 例)，于手术切除标本中选取距肺癌病灶5 cm以上的新鲜肺组织。标本留取大小约2.0 cm×1.0 cm× 1.0 cm，用10%中性甲醛固定24 h后，石蜡包埋，制作蜡块备用行免疫组化。

COPD组纳入标准: ( 1)符合卫生部医政司《慢性阻塞性肺疾病诊疗规范( 2011年版)》的诊断标准［5］; ( 2)肝肾功能正常。排除标准: ( 1)呼吸系统其他疾病; ( 2)其他系统疾病如:高血压病、冠心病、恶性肿瘤、结缔组织病、代谢性疾病、骨关节疾病、神经肌肉疾病等; ( 3) 6个月内接受过手术治疗; ( 4)术前已进行过放疗或化疗。

对照组纳入标准: ( 1)肺功能检查正常; ( 2)肝肾功能正常。排除标准: ( 1)其他呼吸系统疾病; ( 2)其他系统疾病如:高血压病、冠心病、恶性肿瘤、结缔组织病、代谢性疾病、骨关节疾病、神经肌肉疾病等; ( 3) 6个月内接受过手术治疗; ( 4)术前已进行过放疗或化疗。

1.2方法

( 1)一般情况分析:年龄、性别、肺功能等。

( 2)肺功能检测:选用我院肺功能仪，术前1周进行肺功能检测，每次均检测相同的技术指标，包括FVC、FEV1%、FEV1/FVC%和MVV等肺功能参数，吸入沙丁胺醇200 μg 15 min后进行肺功能检测，检测前24 h不使用支气管舒张剂。

( 3)免疫组化检测肺组织RON的表达:采用链霉亲和素-生物素复合物( strept avidin-biotin complex，SABC)法，主要步骤为:切片常规脱蜡至水，滴加3%H2O2室温孵育10 min以灭活内源性过氧化物酶，将切片浸入0.01M枸椽酸盐缓冲液( pH 6.0)加热修复抗原，滴加5% BSA封闭液室温孵育10 min，滴加适当稀释的兔抗大鼠RON一抗( 1∶200)， 4℃孵育过夜，滴加适当稀释的二抗(生物素化山羊抗兔IgG 1∶100)，37℃孵育30 min，滴加试剂SABC ( 1∶100) 37℃孵育30 min，DAB显色，苏木素轻度复染，常规脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

( 4)免疫组化结果判断:在OLYMPUS DP70显微镜高倍镜视野下观察，阳性:棕黄色或黄色颗粒表达于细胞胞浆和(或)胞膜上。应用Image-Pro Plus 6.0图文分析软件，于每张免疫组化染色片的肺泡区和支气管区各随机不重复采图5张，测量每张图片肺泡区和支气管区的平均光密度值，再取其平均值作为该患者肺泡或支气管组织RON蛋白表达含量进行统计分析。

1.3统计学分析

所有数据均采用统计软件SPSS 16.0进行处理，服从正态分布的计量资料以均数±标准差(±s)表示，两组间比较采用t检验;不服从正态分布的计量资料以中位数(四分位间距)表示，即M( QR)，两组间比较采用成组设计两样本秩和检验或配对设计符号秩和检验;性别差异比较采用卡方检验。相关性分析采用Spearson相关。检验水准设为:α= 0. 05。

2　结果

2.1一般情况比较

两组患者年龄、性别比较无显著性差异( P＞0. 05)。COPD组的FEV1/FVC%及FEV1%较对照组均明显降低，具有统计学意义( P均＜0.01) (表1)。

表1　受试者一般情况比较［x±s或M( QR)］

2.2肺组织中RON蛋白的比较

肺组织免疫组化结果显示:在肺泡区，RON蛋白表达于COPD患者的大部分肺泡上皮细胞、肺泡巨噬细胞的细胞膜和细胞浆内，呈明显的棕黄色或黄色颗粒样改变(图1)，而对照组仅部分肺泡上皮细胞的胞膜和胞浆内见淡黄色颗粒的RON蛋白表达(图2)。在支气管区，RON蛋白表达于COPD患者大部分支气管柱状上皮细胞及巨噬细胞的胞膜和胞浆内，呈明显的棕黄色或黄色颗粒样改变(图3)，而对照组仅部分支气管柱状上皮细胞的胞膜或胞浆内见淡黄色颗粒的RON蛋白表达(图4)。经统计学分析，COPD组肺泡区、支气管区平均光密度值均显著高于对照组，有显著统计学意义( P＜0. 05) ; COPD组的支气管区平均光密度值显著高于肺泡区，其差异也具有统计学意义( P＜0. 01) ;而对照组的支气管区平均光密度值与肺泡区比较则无统计学意义( P＞0. 05) (表2)。2．3 COPD患者肺组织中RON蛋白表达量与肺功能的相关分析

表2　两组患者肺组织中RON蛋白的比较［平均光密度，M(QR)］

图1　COPD组肺泡区RON表达：肺泡Ⅰ型细胞（，肺泡Ⅱ型细胞（　），肺泡巨噬细胞（）（SABC×1000）

图2　对照组肺泡区RON表达：肺泡Ⅰ型细胞（，肺泡Ⅱ型细胞（　），肺泡巨噬细胞（　）（SABC×1000）

图3　COPD组支气管区RON表达：肺泡巨噬细胞（，支气管假复层纤毛柱状上皮细胞（），（SABC×1000）

COPD患者肺泡区及支气管区RON蛋白表达量水平与肺功能的FEV1%均呈负相关(表3)。

表3　COPD患者肺组织中RON蛋白表达量与FEV1%相关性

图4　对照组支气管区RON表达：支气管假复层纤毛柱状上皮细胞（），肺泡巨噬细胞（）（SABC×1000）

3　讨论

酪氨酸蛋白激酶受体RON是MSP的特异性受体。而且MSP为目前已知的受体型酪氨酸蛋白激酶RON的唯一特异性配体［6－7］。RON的分布与表达仅限于在上皮起源性细胞中［8］。研究显示，在成年大鼠除了脾脏和心脏外的各器官中均可见RON的转录与表达［9］。另有研究发现［10］，在正常甲状腺细胞中几乎检测不到RON。RON激活的方式有两种，即配体依赖和配体非依赖方式。( 1)配体依赖方式:在病理状况下，pro-MSP经酶水解后，在细胞表面形成成熟的双链蛋白MSP与RON结合后，RON的SEMA域与MSP的β链(主要的受体结合位点［7，11］)以“酶-底物”模式结合而引起RON受体分子同源二聚化，从而诱导其磷酸化和激酶的生物活性，RON构象发生变化，C末端产生特殊的结合信息分子的多功能锚定位点。多功能锚定位点是RON与下游信息分子接触、传递信息的重要结构点［12］; ( 2)配体非依赖方式: RON也能在没有配体MSP存在的情况下进行信号转导，通过整合素介导细胞与细胞外基质( extracellular matrix，ECM) (如Ⅳ型胶原)间的黏附也能引起RON发生自身磷酸化而激活。活化的RON激活多种信号蛋白，通过不同的级联途径向细胞内转导各种信号，如Ras/丝裂原活化蛋白激酶( mitogen activated protein kinase，MAPK)、磷脂酰肌醇3-激酶( phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K) /AKT、jun N-末端激酶( jun N-terminal kinase，JNK) /应激激活蛋白激酶、β-catenin、Smad和NF-κB分子等，调节细胞的生长、迁移、转化和分化［13］。

本研究通过免疫组化方法发现COPD和对照组患者肺组织中肺泡上皮细胞、巨噬细胞和气管支气管纤毛柱状上皮细胞中均有RON蛋白表达，但COPD组肺组织中肺泡区与支气管区RON蛋白的表达明显强于对照组，两组之间的差异具有统计学意义。提示COPD患者肺组织中RON的合成和表达增强。这与动物实验研究结果一致［4］。进一步通过相关分析发现，COPD患者肺组织中RON蛋白表达量水平与肺功能的FEV1%呈负相关( r绝对值＞0. 5)。提示，随着RON蛋白表达量增加，COPD患者FEV1%逐渐降低，因此，我们推测RON在COPD发生发展中起一定的作用，且与COPD的气流受限严重程度相关。本研究还发现，COPD组的支气管区RON蛋白表达量多于肺泡区，然而在对照组中的气管区RON蛋白表达量与肺泡区相差不大，也就是说在COPD患者中，RON更多表达在气管支气管的上皮细胞中。这提示RON更多参与的是气道的炎症机制。

本试验显示，COPD患者肺泡上皮细胞及气道上皮细胞中有较高的MSP受体RON表达，而活化的MSP与RON相结合后可激活信号通路参与炎症反应如刺激气道炎性细胞产生炎症介质如白细胞介素-6( Interleukin-6，IL-6)、白细胞介素-8( Interleukin-6，IL-8)、肿瘤坏死因子-α( Tumor Necrosis Factor-alpha，TNF-α)、白细胞介素-1 β( Interleukin-1 beta，IL-1 β)等增多［14］。提示RON在COPD的发病机制中发挥重要作用，可能主要是参与气道炎症的调节。

参考文献

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(学术编辑:杜飞)

呼吸系统疾病研究专题·论著

The expression and significance of RON receptor tyrosine kinase in chronic obstructive pulmonary disease patients

ZHANG Wen-bo，CHEN Xiao-ju，XIANG Xiao-jun，LENG Chang-yan
( Department of Respiratory Medicine，Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College，Nanchong 637000，Sichuan，China)

【Abstract】Objective: To evaluate the role of receptor tyrosine kinase RON in the pathogenesis of chronic obstructive pulmonary disease( COPD)，we observed the expression and distribution of RON in the lung tissue of people suffering from COPD.Methods: The lung tissue samples were obtained from 20 COPD patients and 25 controls with operation because of lung cancer in North Sichuan Medical College Affiliated Hospital from May 2013 to December 2013.The expression and distribution of RON protein in the lung tissue of each group was observed by immunohistochemistry.Results: The levels of RON protein in the bronchus region and alveolar region of the lung from the COPD patients were outstandingly higher than those of the control( P＜0. 05)，and the expression of RON protein in COPD patients bronchus region was more than the alveolar region.Conclusion: The expression of RON protein in lung tissue of the patients with COPD is stronger.The expression levels of RON protein in lung tissue of the COPD patients are related to the severity of airflow limitation.

【Key words】Receptor tyrosine kinase RON; Chronic obstructive pulmonary disease; Macrophage stimulating protein; Alveolar macrophage ( AM)

作者简介:张文波( 1982－)，男，硕士研究生，住院医师。通讯作者:陈小菊，E-mail: cxj9592@163.com

基金项目:四川省卫生厅科研项目( 070293)

收稿日期:2015－05－25

doi:10. 3969/j. issn. 1005-3697. 2016. 01.01

【文章编号】1005-3697( 2016) 01-0002-04

【中图分类号】R563

【文献标志码】A