HPLC-(UV)-HG-AFS联用技术测定市售紫菜中砷形态

杨 芬,刘金鑫,韦朝阳

HPLC-(UV)-HG-AFS联用技术测定市售紫菜中砷形态

杨 芬1,2,3,刘金鑫1,2,3,韦朝阳1,2

(1.中国科学院地理科学与资源研究所,北京 100101;2.中国科学院陆地表层格局与模拟重点实验室，

北京100101;3.中国科学院大学资源与环境学院，北京100049)

为优化高效液相色谱-氢化物发生-原子荧光光谱(HPLC-HG-AFS法)同时测定As(III)、DMA、MMA、As(V)和AsB五种砷形态的方法，选用不同提取剂和流动相测定了市售紫菜中砷的形态，考察不同比例甲醇-水溶液作为提取剂、不同流动相对测定紫菜中砷形态的影响。试验结果表明：流动相选择5 mmol/L (NH4)2HPO4，在pH值为9.0时能有效分离五种砷形态；市售紫菜中的总砷含量为7.9～13.0 mg/kg，未检测到As(III)、As(V)、MMA和DMA；通过对比不同比例甲醇-水溶液的提取效果，发现1∶9甲醇-水溶液和3∶1甲醇-水溶液提取紫菜中砷形态的提取效果较好。该试验结果可为紫菜等植物样品中砷形态的提取提供参考。

紫菜；砷形态；总砷含量；HPLC-HG-AFS；甲醇-水；流动相

砷(As)是一种有毒的类金属，在环境中无处不在。研究表明，砷的毒性和其存在形态密切相关。毒性最强的砷化氢(AsH3)等气态砷在自然界中存在较少，而无机态的亚砷酸盐(As(III))和砷酸盐(As(V))为毒性较强的两种主要形态，一甲基胂酸(MMA)和二甲基胂酸(DMA)的毒性较弱，而在一些生物体内存在的砷甜菜碱(AsB)、砷胆碱(AsC)以及砷糖类等砷形态被认为基本无毒[1]。紫菜因富含蛋白质、碳水化合物、不饱和脂肪酸、维生素和矿物质，具有重要的营养价值，而深受人们的喜爱而食用，如紫菜汤、寿司等[2]。由于不同形态砷的毒性差异较大，用总砷含量来评估砷暴露的健康风险还不够全面，所以对环境介质中不同形态的砷进行分析具有重要意义。

目前，分析环境介质中砷形态的方法主要有高效液相色谱-氢化物发生-原子荧光光谱(或原子吸收光谱)法(HPLC-HG-AFS法、HPLC-HG-AAS法)、高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法(HPLC-ICP-MS法)、高效液相色谱-有机质谱法(HPLC-ES-MS法)等联用技术[3]。由于HPLC-HG-AFS法具有分离能力强、操作简单、价格相对低廉等优点，在实验室比较普及。前人已采用该方法对As(III)、DMA、MMA、As(V)四种砷形态测定方法进行了研究，但对AsB测定方法的研究较少。另外，随着砷形态分析要求的提高，样品前处理技术也越来越受到重视，通常对于不同基质的砷形态，提取剂使用不同。为此，本文以紫菜为研究对象，采用不同比例甲醇-水作为提取剂，利用HPLC-(UV)-HG-AFS联用技术，建立了一种同时测定As(III)、DMA、MMA、As(V)和AsB五种砷形态的分析方法。

1 材料与方法

1.1 试验样品及其前处理

试验样品购自北京华润万家超市，主要为浪奇、润之家、新阳洲、塞翁福和富昌五种不同品牌的紫菜，其样品详细信息见表1。将购买的紫菜拆封，用高速万能粉碎机多次磨碎至粉末状，过0.15 mm筛，编号装入自封袋放入冰箱冷藏备用。

表1 紫菜样品相关信息

1.2 试验试剂

试验所用试剂均为分析纯或更高纯度，超纯水(18 MΩ·cm)由超纯水机(美国)制得。所用的试管及容器均用10%的硝酸泡制过夜，使用之前用超纯水冲洗干净。主要的化学药品为HNO3(优级纯)、HCl(超纯)、H2O2(30%、分析纯)、KBH4(分析纯)、KOH(优级纯)、硫脲(分析纯)、(NH4)2HPO4(分析纯)、甲醇(色谱纯，99.9%)。

试验所用标准物质均购自中国计量科学研究院。测定总砷含量以GSV-2灌木枝叶(GBW07603)为标准物质；砷形态标准物质分别为砷酸根溶液标准物质[As(V)，GBW08667]、亚砷酸根溶液标准物质[As(III)，GBW08666]、一甲基砷溶液标准物质(MMA ，GBW08668)、二甲基砷溶液标准物质(DMA ，GBW08669)、砷甜菜碱溶液标准物质(AsB，GBW08670)。

1.3 试验方法

1.3.1 总砷含量测试方法

称取待测样品200～300 mg放入25 mL试管中，加入高纯浓硝酸4 mL，加带孔玻璃塞，室温静置过夜；取下玻璃塞，用电热板80℃缓慢加热1～2 h，加入约1 mL双氧水，加热电热板至140℃，消煮至溶液变为浅黄透明状，取出静置冷却；用超纯水定容到25 mL，4℃贮存待测；取5 mL待测液加入5 mL还原剂(10%HCl+5%硫脲)，混合均匀后(0.5～1 h)上机测试。总砷含量采用氢化物发生-原子荧光光谱法(HG-AFS法，北京吉天)测定；样品砷浓度采用砷浓度标准曲线-荧光强度峰面积法进行计算。1.3.2 砷形态测试方法

称取400～500 mg紫菜样品于50 mL离心管中，分别加入甲醇-水提取剂，在室温下超声提取15 min，并以8 000 r/min转速离心分离10 min，转移上清液，每个样品重复2次上述提取步骤；合并两次提取的上清液，用氮吹仪吹赶提取液中的甲醇，并分别浓缩至15 mL，用超纯水定容至25 mL；上机测试前过0.22 μm微孔滤膜，取5 mL左右提取液放入冰箱待测。砷形态采用北京吉天仪器公司S20原子荧光形态分析仪(HPLC-(UV)-HG-AFS)进行测定，仪器相关参数配置见表2。由于AsB需要消解之后才能与还原剂生成可被原子荧光检测器检测的砷化物，因此本试验选用(无)在线紫外消解连接系统。

1.4 HPLC-HG-AFS法测定砷形态

1.4.1 总砷标准曲线

分别取5 mL的10 ppb、20 ppb、40 ppb、60 ppb、80 ppb、100 ppb的标准溶液，分别加入5 mL的还原剂，混合均匀后(0.5～1 h)上机测试。由标准系列砷浓度与荧光强度所得的总砷含量的回归方程为I=30.2704C+23.206 7，相关系数r=0.998 9[其中，I为荧光强度(mV);C为砷浓度(mg/kg)]。可见，在标准系列砷浓度范围内，荧光强度与砷浓度的线性相关性良好。

表2 HPLC-(UV)-HG-AFS仪器相关参数配置

1.4.2 砷形态标准曲线

图1 标准系列四种砷形态的色谱流出图Fig.1 Chromatograms of the four standard As species

分别取5 mL的10 ppb、40 ppb、80 ppb、100 ppb的标准溶液上机测试，色谱流出图如图1所示。由图1可见，四种形态砷化合物在阴离子交换柱下能完全分离，并以As(III)、DMA、MMA、As(V)的次序流出色谱柱。由标准系列砷浓度与对应的峰面积的回归方程分别为：As(III)标准系列，S=9 387.8C+3 866.6，相关系数r=0.998 7；MMA标准系列，S=9 522.8C+2 996.9，相关系数r=0.999 9；DMA标准系列，S=7 467.6C+3 629.9，相关系数r=0.999 3；As(V)标准系列，S=5 407.4C+1 366.3，相关系数r=1.000[其中，S为峰面积;C为砷浓度(mg/kg)]。可见，在标准系列砷浓度范围内，峰面积与砷浓度的线性相关性良好。

1.5 样品分析质量控制

本试验采用空白值、标准物质和平行样对试验数据进行分析质量控制。选用国家标准物质(GSV-2 灌木枝叶，GBW07603)进行分析精度验证，同时选择富昌紫菜做两组平行样进行同步消解测试，并对上机测试的溶液选择性重复测定，3次测试结果的相对标准偏差<5%为合格。总砷含量分析质量控制结果见表3。

表3 总砷含量分析质量控制结果

2 结果与分析

2.1 总砷含量分析

对五种不同品牌的紫菜中总砷含量测试结果见图2。由图2可见，紫菜中总砷含量在10 mg/kg左右，几种品牌紫菜中总砷含量相差不大，其中以新阳洲牌紫菜中砷浓度最低，仅为7.9 mg/kg，而浪奇牌紫菜中砷浓度则最高，为13.0 mg/kg。王亚等[4]用HPLC-HG-AFS法测定了南通产紫菜中总砷含量，其含量范围为14.0～ 42.1 mg/kg；方军等[5]用ICP-MS法测定了广东产紫菜中的总砷含量为33.8 mg/kg；Almela等[6]对在西班牙出售的紫菜中总砷含量进行了研究结果，发现来自中国、日本、韩国、西班牙的紫菜产品中总砷含量在18.4～58.3 mg/kg范围内。本试验测试的紫菜样品中总砷含量均低于以上文献报道的总砷含量范围，可能与紫菜的来源地有关。

图2 紫菜样品中总砷含量Fig.2 Concentrations of total As in porphyra samples

2.2 砷形态分析

2.2.1 HPLC-(UV)-HG-AFS法测定砷形态时流动相的选择

图3 在线紫外消解下不同pH值流动相五种砷 形态的色谱流出图Fig.3 Chromatograms of five As species digested by on-line UV and detected by using mobile phases with different pH values

采用HPLC-(UV)-HG-AFS法，为实现更好地分离As(III)、DMA、MMA、As(V)和AsB五种砷形态，试验选用5 mmol/L (NH4)2HPO4(用氨水调节pH值分别为8.45、8.65、8.85、9.00)作为流动相，探讨不同pH值对砷形态的分离效果，其五种砷形态的色谱流出图见图3。由图3可见，在不同pH值下，AsB、As(III)、DMA、MMA和As(V)的峰依次分离，后三种形态(DMA、MMA、As(V))在不同pH值下均能有效分离，其中AsB的出峰时间与As(III)相近，峰高明显低于其他四种砷形态，同时As(V)峰高次之，但其出峰时间可长达24 min；当流动相pH值为8.45、8.65、8.85时As(III)和AsB的分离效果差，而流动相pH值为9.00时则能实现两者的有效分离。因此，试验选取5 mmol/L (NH4)2HPO4(用氨水调节pH值至9.00)作为流动相，五种砷形态可依次完全分离，且峰形尖锐、对称性好。由于As(III)、DMA、MMA和As(V)极易转化，而其他砷形态(AsB、AsC、三甲基胂氧化物、TETRA、胂糖等)化学性质稳定，能在低温下保持形态多年不变[7]，因此建议在实际砷形态分析时，待测样品应在第一时间测定As(III)、DMA、MMA和As(V)。2.2.2 不同比例甲醇-水提取剂对砷形态测试的影响

影响砷形态测定结果的因素有很多，主要有提取剂的类型、辅助提取方法、提取时间和温度等[8]。通常对于不同基质，砷形态提取剂类型选择有所不同。一般来说，由于许多砷形态都是水溶性的，因此用纯水提取即可，或者用不同比例的甲醇-水提取[9]。对于生物样品的砷形态的提取，由于样品中有机物较多，砷的赋存形式又以有机砷为主，因此最常用的方法就是用不同比例的甲醇-水混合体系(如1∶9、1∶1、9∶1)进行提取，其中以1∶1的甲醇-水体系运用得最多[10]。

本试验选用不同比例的甲醇-水(纯水、1∶9、1∶3、1∶1、3∶1、9∶1)等作为富昌紫菜中砷形态提取剂，并按照砷形态测试方法进行测试，结果发现采用不同比例甲醇-水的提取剂，几种品牌紫菜只在5.6 min时色谱图就出现一明显高峰，但可以判定均不是As(III)、DMA、MMA、As(V)和AsB其中的任何一种。按照未知砷形态的峰形，本试验紫菜中未知砷形态部分的数据均为HPLC-HG-AFS法测试结果。不同国家和地区紫菜产品中砷形态检测出无机砷的报道较少，二甲基砷( DMA) 亦有报道，报道最多的是砷糖，其含量一般在90%～98%[5]。目前还缺少砷糖的标准物质，相关文献报道中基本采用的是将实验室中从天然物质中提取出的四种砷糖化合物(磷酸砷糖PO4-sug、甘油砷糖Gly-sug、硫酸砷糖SO4-sug和磺酸砷糖SO3-sug)作为标准物质，对紫菜中的砷形态进行定性定量分析[11]。采用上述方法，Wei等[12]测得中国紫菜中的砷形态主要为磷酸砷糖和甘油砷糖，其含量分别为0.3～13.9 mg/kg (干重)和 0.7～6.2 mg/kg；李卫华等[13]测得中国不同海域紫菜中砷糖为主要砷形态，且以磷酸砷糖为主要化合物(0.4～12.7 mg/kg),其次为甘油砷糖(1.0～7.8 mg/kg)。因此，本试验紫菜中的砷形态应以砷糖形式为主。由于缺少该物质的商业标准物质，对其中的砷糖绝对含量无法量化，因而本文只能采用单位质量砷糖峰面积来比较几种品牌紫菜之间砷糖的含量变化。为便于比较，采用极差标准化方法对砷糖峰面积进行归一化处理，处理后的结果见表4。通过对比，初步选择出提取液准确度相对较高的提取剂，即1∶9甲醇-水溶液和3∶1甲醇-水溶液，在此基础上对所有紫菜样品进行砷形态测试。

表4 超纯水及不同比例甲醇-水提取下紫菜中砷形态的分析结果

注：紫菜样品为富昌牌；砷糖峰面积标准化后数据依据X’= (X-Xmin)/(Xmax-Xmin)进行标准化计算后得到。

对于甲醇-水不同比例提取剂的选择，1∶9甲醇-水溶液和3∶1甲醇-水溶液采用HPLC-HG-AFS法测试的色谱图中砷糖的峰形略有不同，见图4。总体来说，3∶1甲醇-水溶液在提取过程中比较简便，但是砷糖的峰形不够尖锐，峰宽较宽；而1∶9甲醇-水溶液提取后砷糖的峰形较好，但是氮吹过程较长，有可能造成砷的损失。因此，这两种提取剂各有所长，可根据实际情况进行选择使用。

图4 1∶9和3∶1甲醇-水溶液提取下的砷糖的 色谱流出图Fig.4 HPLC-HG-AFS chromatograms of As species by using 1∶9 methanol-water and 3∶1 methanol-water mixture

2.2.3 不同品牌紫菜中的砷形态

本试验分别用1∶9和3∶1甲醇-水溶液作为提取剂测试不同品牌紫菜中的砷形态，结果发现：五种不同品牌紫菜中均没有检测出As(III)、DMA、MMA、As(V)，同时砷形态图谱与富昌紫菜也完全一致，可判断也均为砷糖；但是不同品牌紫菜中砷糖相对含量(峰面积)有所差异(见图5)，对两组平行数据求平均值后发现，富昌、润之家、塞翁福和新阳洲四种品牌紫菜中砷糖相对含量并没有明显差异，均在550左右，而浪奇牌紫菜中砷糖相对含量最低，仅达到250左右。

图5 1∶9和3∶1甲醇-水溶液提取下砷糖相对含量 (峰面积)对比Fig.5 Comparison of relative content (peak areas) of arsenosugars by using 1∶9 methanol-water and 3∶1 methanol-water mixture

2.3 紫菜中总砷含量与砷形态分析

对五种不同品牌紫菜中总砷含量以及1∶9和3∶1甲醇-水溶液提取砷形态所得的砷糖相对含量分别进行标准化(1-2型)处理，即代入公式X’=1+(X-Xmin)/(Xmax-Xmin)后，其计算结果见图6。由图6可见，富昌、润之家、塞翁福三种品牌紫菜中总砷含量与砷糖相对含量呈现很好的一致性，指示这三种品牌紫菜中砷形态主要以砷糖形式存在；而浪奇牌紫菜中总砷含量相对最高，但是砷糖相对含量却最低，新阳洲牌紫菜中砷糖相对含量较高，但是其总砷含量却是五种紫菜中最低的，因此浪奇牌紫菜中除砷糖外，还应该存在有其他形态的砷。本试验未在几种紫菜样品中测出无机砷和甲基砷，采用HPLC-HG-AFS法对这几种形态砷的检测限较低，本试验也进行了可靠的分析质量控制，因此不能排除浪奇牌紫菜中还存在其他形态砷的可能性；而总砷含量最低的新阳洲品牌紫菜，其砷糖相对含量并不是最低的，反映各来源紫菜样本中砷糖形态的比例有很大的不同。

图6 标准化(1-2型)处理后不同提取剂下5种品牌紫菜中 总砷含量与砷糖相对含量的对比Fig.6 Comparison of relative content of total arsenic and arsenosugars after standardization in five bands of Porphyra by different extractants

3 结论与讨论

砷元素长期以来一直被视为是一种对人体有害的毒性元素，从本试验检测结果来看，紫菜中砷含量在10 ppb左右，并且主要是以无毒的砷糖形式存在。浪奇牌紫菜中可能存在除无机砷、甲基砷以及砷糖以外的砷形态，还有待进一步研究。本试验采用不同提取剂提取几种品牌紫菜中砷形态均未检测出无机砷和甲基砷，而食品中对人体有害的砷形态主要为无机砷和甲基砷，尤其是无机的亚砷酸[1]，因此长期食用这几种品牌紫菜不会对人体健康造成危害。由于砷形态的提取受多种因素的影响，本试验通过不同比例的甲醇-水溶液提取紫菜中的砷形态，结果发现：1∶9甲醇-水溶液和3∶1甲醇-水溶液对砷形态的提取效果相对较好，对于今后的紫菜等植物样中砷形态的提取等研究具有参考价值。另外，本文尝试利用HPLC-UV-HG-AFS法同时测定As(III)、DMA、MMA、As(V)、AsB五种砷形态，并取得了一定的效果，可以推广应用。

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Arsenic Speciation in Commercial Porphyra by HPLC-(UV)-HG-AFS

YANG Fen1,2,3,LIU Jinxin1,2,3,WEI Chaoyang1,2

(1.InstituteofGeographicSciencesandNaturalResourcesResearch,ChineseAcademyofSciences,Beijing100101,China;2.KeyLaboratoryofLandSurfacePatternandSimulation,ChineseAcademyofSciences,Beijing100101,China;3.CollegeofResourcesandEnvironment,ChineseAcademyofSciences，Beijing100049,China)

In order to optimize the method of high performance liquid chromatography and hydride generation atomic fluorescence spectrometry (HPLC-HG-AFS) for simultaneous determination of five arsenic species including AsB, As (III), As (V), MMA, DMA and AsB,this paper uses different extractants and mobile phases to detect arsenic speciation in commercialPorphyra,and investigates the influence of different extractants in various methanol-water ratios and different mobile phases on the arsenic speciation detection.The experimental results indicate that the five arsenic compounds can be effectively separated when the samples are digested by on-line UV with a mobile phase of 5 mmol/L (NH4)2HPO4and pH being 9.0;the total arsenic concentration varies from 7.9 mg/kg to13.0 mg/kg, while As (III)，As (V)，MMA and DMA are not found in allPorphyrasamples;the extraction effect is relatively good when extracting arsenic species fromPorphyrawith 1∶9 (v/v) methanol-water and 3∶1 methanol-water mixture. The experimental results can provide a reference for extracting arsenic species from botanic samples such asPorphyra.Key words:porphyra;arsenic speciation;total arsenic content;HPLC-HG-AFS;methanol-water mixture;mobile phase

1671-1556(2016)02-0060-06

2015-08-18

2016-01-09

国家自然科学基金项目(41271477、41571470)

杨 芬(1989—)，女，博士研究生，主要研究方向为环境中砷的迁移转化与生态效应。E-mail:yangf.13s@igsnrr.ac.cn

X836；O65

A

10.13578/j.cnki.issn.1671-1556.2016.02.012